Ферментативный катализ уравнение михаэлиса ментен

Ферментативный катализ. Уравнение Михаэлиса-Ментен и его анализ.

биокатализ, ускорение химических реакций под влиянием ферментов. В основе жизнедеятельности лежат многочисленные химические реакции расщепления питательных веществ, синтеза необходимых организму химических соединений и трансформации их энергии в энергию физиологических процессов (работа мышц, почек, нервная деятельность и т.п.). Все эти реакции не могли бы происходить с необходимой для живых организмов скоростью, если бы в ходе эволюции не возникли механизмы их ускорения с помощью Ф. к.

Уравне́ние Михаэ́лиса — Ме́нтен — основное уравнение ферментативной кинетики, описывает зависимость скорости реакции, катализируемой ферментом, от концентрации субстрата. Простейшая кинетическая схема, для которой справедливо уравнение Михаэлиса:

Уравнение имеет вид:

,

— максимальная скорость реакции, равная ;

— константа Михаэлиса, равная концентрации субстрата, при которой скорость реакции составляет половину от максимальной;

— концентрация субстрата.

При анализе кинетич. закономерностей в ферментативных реакторах широкое теоретич. и эксперим. развитие получили «идеальные» модели реакторов, проточный безградиентный реактор (проточный реактор идеального перемешивания), проточный реактор с идеальным вытеснением, мембранный реактор.

Дата добавления: 2015-04-18 ; просмотров: 22 ; Нарушение авторских прав

Зависимость фермента от количества субстрата описывает ферментативная кинетика

Уравнения Михаэлиса-Ментен и Лайнуивера-Берка

Общую теорию ферментативной кинетики и зависимость активности фермента от субстрата.описали Л.Михаэлис и М.Л.Ментен, выразив его в своем уравнении. Бриггс и Холдейн усовершенствовали их уравнение, введя введя в него константу Михаэлиса (Km), определяемую экспериментально.

Уравнение Михаэлиса-Ментен показывает взаимосвязь максимально возможной скорости, реальной скорости реакции, константы Михаэлиса и концентрации субстрата. Так как пользоваться графиком, построенным в прямых координатах V и [S] для точных расчетов неудобно, то Г.Лайнуивер и Д.Бэрк преобразовали уравнение Бриггса–Холдейна в обратные координаты.

Уравнение Михаэлиса-Ментен

Уравнение Лайнуивера-Бэрка

На самом деле уравнение Михаэлиса-Ментен в данном виде предложили Бриггс и Холдейн, но в честь основоположников оно носит название Михаэлиса-Ментен.

Выделяют три основных решения уравнения Михаэлиса-Ментен:

1. Концентрация субстрата равна величине константы Михаэлиса ([S] = Km).
В этом случае, решая уравнение Михаэлиса-Ментен, получаем, что скорость реакции V будет равна половине максимальной Vmax.(V = ½ Vmax).

В математическом смысле Km соответствует концентрации субстрата при которой скорость реакции равна половине максимальной. Ее биологический смысл заключается в характеристике сродства фермента к субстрату, а именно: увеличение величины Кm означает снижение сродства фермента к субстрату.

2. Концентрация субстрата значительно больше Km ([S] >> Km). В этом случае величиной Km можно пренебречь, при решении получим, что скорость реакции максимальна (плато на графике).

3. Концентрация субстрата значительно меньше Km ([S]

Ферментативный катализ уравнение михаэлиса ментен

МЕХАНИЗМ ФЕРМЕНТАТИВНОГО КАТАЛИЗА

Катализ приводит к ускорению достижения равновесия за счет снижения энергии активации (Еа), часто ступенчато.

Три стадии процесса: 1) E + S —— ES (K = k1/k-1) (БЫСТРАЯ) 2) ES —— EP (k2)(медленная) 3) EP —- E + P Таким образом, в момент равновесия скорости образования и исчезновения энзимсубстратного комплекса (ES) равны: E + S —- ES —— EP — E + P

ВЛИЯНИЕ НА НАЧАЛЬНУЮ СКОРОСТЬ РЕАКЦИИ КОНЦЕНТРАЦИЙ ФЕРМЕНТА [E] и СУБСТРАТА [S].

[E]- ЗАВ-ТЬ ЛИНЕЙНАЯ, [S]- ЗАВ-ТЬ ГИПЕРБОЛИЧЕСКАЯ. (Это значит, что при малых S- порядок первый, далее переходит в нулевой). Пунктиром на графике зависимости скорости от концентрации фермента показано влияние ферментных ядов (ингибиторов), проявляющееся в медленном нарастании скорости реакции до момента, пока не будет преодолено влияние яда повышением количества энзима.

УРАВНЕНИЕ МИХАЭЛИСА — МЕНТЕН

При формулировке кинетического выражения для скорости ферментативной реакции Бриггс и Холдейн (Briggs & Haldane, 1925) сделали три допущения:
1) Стационарное состояние реакции в момент равновесия, когда скорости образования и расходования ES равны;
2) Весь фермент в условиях насыщающих концентраций субстрата превращается в энзимсубстратный комплекс ES;
3) Если весь фермент в виде ES, то скорость реакции максимальна и Vmax=k₂[ES].
Образование ES: [ES]=k₁[S][E] (I)
Расходование ES: [ES]=k_-1[ES]+k₂[ES] (II)
Приравнивая выражения (I) и (II) и сокращая обе части на k₁ получаем:
[S][E] = [ES](k_-1 + k₂)/k₁ = [ES]Km, где Km = (k_-1 + k₂)/k₁
Выразим равновесную концентрацию [E] через начальную [Eo]: [E] = [Eo] — [ES]
[S]([Eo]-[ES])= [ES]Km, переносим [S] в правую часть выражения и делим обе части на [ES]:
[Eo]/[ES]=Km/[S]+1= (Km+[S])/[S] (III)
Поскольку трудно (если не невозможно) измерить [ES], произведем замену с учетом того, что в насыщающих концентрациях [S] весь [Eo] перейдет в [ES] и максимальная скорость при этом будет равна Vmax=k₂[ES]=k₂[Eo].
В это же время скорость реакции равна V=k₂[ES]. Через отношение этих скоростей выразим [Eo]/[ES]:
V/Vmax= [ES]/[Eo]
В уравнении (III) произведем замену отношения [Eo]/[ES] на Vmax/V и получаем:
V = Vmax[S]/(Km+[S])
Это и есть уравнение Михаэлиса-Ментен. Название было закреплено за ними, несмотря на то, что Леонор Михаэлис и Мод Ментен только постулировали положение о том, что фермент обратимо связывается с субстратом (1913). Основу ферментативной кинетики положил Виктор Генри в 1903 году, впервые предположивший зависимость между концентрациями субстрата и фермента в ферментативных реакциях.

Графическая зависимость для уравнения имеет вид:

Константа Михаэлиса измеряется в молях на литр и бывает от 10 -2 до 10 -7 , чем меньше Кm, тем активнее фермент. При V=1/2Vmax, имеем Km = [S]. Однако, определение Vmax затруднительно по асимптоте. Для устранения этого неудобства ХАНС ЛАЙНУИВЕР и ДИН БЭРК приравняли обратные зависимости левой и правой частей уравнения.

Графическое выражение для скорости реакции в координатах Лайнуивера-Бэрка имеет вид прямой линии, отсекающей на оси Х значение -1/Km, а на оси Y- значение 1/V max:

ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ И рН НА АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТА

В общем, для ферментов имеется связь константы скорости и температуры, выражаемая: 2,3 lgK = B- Ea/RT, где Еа- энергия активации, В-частота столкновений.
Однако, указанная зависимость прямолинейна лишь на ограниченном отрезке, так как с ростом температуры наблюдается денатурация фермента.
Зависимость активности фермента от рН также проходит через максимум. Кислотность среды влияет на заряды в молекуле фермента и, тем самым, на его способность к связыванию субстрата.

Единицы активности:
Е (станд. ед) — количество Ф., которое превращает 1 мкМоль субстрата за 1 мин.

КАТАЛ- кол-во Ф., превращающее субстрат со скоростью 1 Моль/сек.

1 КАТАЛ = 60 000 000 Е.

2) НЕОБРАТИМЫЕ (КАК ПРАВИЛО- НЕПРИРОДНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ — NaF (ингибитор фосфатаз), п-хлормеркурибензоат (связывает группировки -SH), диизопропилфторфосфат (протеиназ и эстераз)- эти ингибиторы действуют необратимо.

ОБРАТИМЫЕ ИНГИБИТОРЫ- клеточные метаболиты и типы ингибирования

а) КОНКУРЕНТНОЕ ингибирование
б) НЕКОНКУРЕНТНОЕ ингибирование
в) БЕСКОНКУРЕНТНОЕ ингибирование

а) КОНКУРЕНТНОЕ ИНГИБИРОВАНИЕ- когда за активный центр фермента вместе с субстратом конкурирует ИНГИБИТОР:
Е + I = EI Ki = [E][I] / [EI], чем меньше Ki, тем сильнее ингибитор.

Так, малоновая (1), щавелевоуксусная (2) и глутаровая (3) кислоты ингибируют фермент СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗУ, субстратом которой является янтарная кислота (4) (СУКЦИНАТ), так как они сходны по строению с субстратом:

Другой пример. Сульфаниламидные антибактериальные препараты имеют сходное строение с парааминобензойной кислотой и являются конкурентными ингибиторами в синтезе бактериями фолиевой кислоты (фактора роста бактерий). У человека нет такого метаболического пути и в лечебных дозах они не влияют на жизнедеятельность человека, оказывая общий БАКТЕРИОСТАТИЧЕСКИЙ эффект (нарушая в некоторой степени деятельность кишечной микрофлоры):

2) НЕКОНКУРЕНТНОЕ ИНГИБИРОВАНИЕ ПРОЯВЛЯЕТСЯ ПРИ СВЯЗЫВАНИИ ИНГИБИТОРА С ФЕРМЕНТОМ ВНЕ АКТИВНОГО ЦЕНТРА, но при этом меняется структура активного центра и связь с субстратом становится невозможной.

E + I —> EI , EI + S —-> (невозможно)

3) БЕСКОНКУРЕНТНОЕ ИНГИБИРОВАНИЕ — результат присоединения ингибитора ТОЛЬКО ПОСЛЕ образования ЭНЗИМСУБСТРАТНОГО КОМПЛЕКСА:
E + S = ES ES + I = ESI

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТИПА ИНГИБИРОВАНИЯ
1) КОНКУРЕНТНЫЙ ИНГИБИТОР увеличивает Кm и не изменяет V max.
2) НЕКОНКУРЕНТНЫЙ ингибитор не изменяет Кm и снижает V max.
3) БЕСКОНКУРЕНТНЫЙ ингибитор в одинаковой степени снижает Кm и V max:

Некоторые продукты ферментативных реакций также выступают в роли ингибиторов. Так, глюкоза ингибирует фермент Г-6-фосфатазу:
Глюкозо-6-фосфат + Н 2 О — Глюкоза + Н 3 РО 4

Ингибирование избытком субстрата наблюдается в ряде случаев в результате блокирования активного центра по схеме:

1) ПУТЕМ ЗАЩИТЫ Ф. ОТ ИНАКТИВИР. ВЛИЯНИЙ

2) ПУТЕМ ВОЗДЕЙСТВИЯ НА СУБЪЕДИНИЦЫ БЕЛКОВ Ф.

Ферменты-протеинкиназы имеют 4-ную структуру, состоят их 2-х субъед- каталитической и регуляторной. Активатор воздействует на регуляторную, а в результате обнажается каталитическая субъединица:

Аллостерическими эффекторами называют ингибиторы (отрицательные эффекторы) и активаторы (положительные эффекторы) энзимов, регулирующие активность ферментов в широких пределах, не затрагивая при этом активного центра, поскольку воздействуют на него опосредованно, присоединясь к молекуле фермента ВНЕ активного центра. Они способны управлять конформацией активного центра таким образом, что присоединение субстрата либо облегчается значительно, либо вовсе становится невозможным:

1) Структура аллостерических эффекторов отлична от природного субстрата фермента.
2) Высокоспецифичны
3) Катализируют фермент первой цепи процесса.

Среди аллостерических эффекторов различают эффекторы V-типа, которые подобно неконкурентным ингибиторам (см. выше) изменяют значение Vmax:

и эффекторы К-типа, изменяющие значение Km, как это свойственно конкурентным ингибиторам:

Для ферментов с аллостерической регуляцией, а также и для ферментов с четвертичной структурой, состоящих из нескольких субединиц, характерны сигмоидальные (S-образные) кинетические кривые.

КООПЕРАТИВНЫЙ ЭФФЕКТ
Характерен для ферментов, имеющих 2 и более субъединиц. Присоединение субстрата или эффектора к одной из субъединиц облегчает последующие присоединения к оставшимся субъединицам. Типичный пример кооперативного эффекта- перенос кислорода молекулами гемоглобина.

ПРОФЕРМЕНТЫ
Неактивная форма Ф. Активация осуществляется удалением части полипептидной цепи, обнажению активного центра, при помощи специфических ферментов. Биологический смысл- в месте продукции Ф. мог бы вызвать нежелательные последствия (переваривание и т.д.).

ИЗОФЕРМЕНТЫ
отличные по структуре, но выполняющие одну и ту же функцию. Изоферментами, в частности, существуют алкогольдегидрогеназа и целых 5 изомеров лактатдегидрогеназы. Изоферменты могут различаться по каталитической активности, несмотря на то, что катализируют одну и ту же реакцию. Так, в клетках печени человека различаются цитоплазматическая ацетальдегиддегидрогеназа (низкоактивная, с высоким значением Km) и митохондриальная ацетальдегиддегидрогеназа (AcDH), с малым значением Km. Последнее обстоятельство является биохимической причиной непереносимости алкоголя у коренного населения Юго-Восточной Азии, которое связано с практическим отсутствием у них (по генетическим причинам) митохондриальной AcDH и превращение образовавшегося из этанола ацетальдегида осуществляется у них малоактивной цитоплазматической AcDH.

ПРИМЕНЕНИЕ ФЕРМЕНТОВ В ДИАГНОСТИКЕ И ДРУГИХ ОБЛАСТЯХ

Ферментные препараты и регуляторы их активности находят все более широкое применение в различных областях медицины, промышленности и науки.
В медицине используются энизимы, как терапевтические средства:
— СТРЕПТОКИНАЗА- смесь энзимов из семейства Streptococcus, активизирующих ПЛАЗМИНОГЕН и образование ПЛАЗМИНА, приводящее к растворению ФИБРОЗНЫХ ТРОМБОВ в кровеносных сосудах. Рекомбинантный тканевый активатор плазминогена rh-tPA производится генно-инженерным способом на E.Coli и вводится человеку.
— АСПАРАГИНАЗА используется в терапии ЛЕЙКЕМИИ взрослых. Опухолевые клетки нуждаются в АСПАРАГИНЕ, который они извлекают из плазмы крови. Внутривенное введение (i.v.) аспарагиназы снижает содержание аспарагина и замедляет рост раковых клеток. К сожалению, достижение высоких терапевтических доз таким способом невозможно.
ЭНЗИМЫ, КАК ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ

Измерением энзиматической активности в образцах крови можно осуществлять диагностику ряда патологий. Так, повреждение сердечной мышцы (инфаркт миокарда) диагностируется повышенной активностью изоэнзимов КРЕАТИНФОСФОКИНАЗЫ 2 и 3 (СРК-2 и 3) и соотношению активностей ферментов ЛАКТАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ 1 и 2 (LDH1/LDH2) методами иммуноферментного анализа (ИФА) или электрофореза. Активность указанных изоферментов СРК повышается после момента острой грудной боли, достигая максимума на 1-е сутки (СРК-3) и 2-е сутки (СРК-2), а соотношение активностей LDH1/2 от 0,75 (в норме) изменяется до 1,25 (инфаркт миокарда).

В последнее время широко распространяется тест на тропонин, который измеряет измеряет уровень белков тропонинов Т или I в крови. Эти белки высвобождаются при повреждении сердечной мышцы в результате гликолиза при кислородном голодании (инфаркт миокарда), сердечном приступе. Чем обширнее была область инфаркта, тем большее количество тропонинов Т и I окажется в крови.

В терапевтических целях широко используются ингибиторы ферментов. Так, блокадой АЦЕТАЛЬДЕГИДДЕГИДРОГЕНАЗЫ в стационарных условиях осуществляется терапия хронического алкоголизма. Широкое распространение получили антибактериальные сульфаниламидные препараты на основе СУЛЬФАМЕТОКСАЗОЛА (входящие в состав препарата БИСЕПТОЛ и его аналогов), блокирующие синтез у бактерий фолиевой кислоты.
В промышленности широко применяются иммобилизованные ферменты. С их помощью синтезируются лекарственные препараты (например, ПРЕДНИЗОЛОН) из дешевых предшественников (ХОЛЕСТЕРИН), с высокой стереоспецифичностью, быстро и качественно. Таким же способом, с иммобилизованной бета-ГАЛАКТОЗИДАЗОЙ цельное молоко очищается от ЛАКТОЗЫ, после чего оно становится возможным для употребления чувствительными к галактозе лицами.
Существует еще огромное число примеров использования ферментов, возрастающее с каждым годом.