Физический смысл параметров уравнения михаэлиса ментен

Вывод уравнения Михаэлиса-Ментен.

Полный математический анализ ферментативной реакции приводит к сложным уравнениям, не пригодным для практического применения. Наиболее удобной оказалась простая модель, разработанная в 1913 г Михаэлисом и его сотрудницей Ментен. Она объясняет характерную гиперболическую зависимость скорости реакции при постоянной концентрации фермента от концентрации субстрата и позволяет получать константы, которые количественно характеризуют эффективность фермента.

Модель Михаэлиса-Ментенисходит из того, что вначале субстрат (S) обратимо образует с ферментом (E) комплекс (ЕS), который ,быстро превращается в продукт Р, что можно выразить следующей схемой:

Математическая обработка этой системы уравнений с использованием закона действующих масс и уравнения материального баланса позволяет вывести уравнение, названное в честь авторов уравнением Михаэлиса–Ментен, выражающее количественное соотношение между концентрацией субстрата и скоростью ферментативной реакции:

Вывод уравнения Михаэлиса-Ментен:

Скорость прямой реакции образования ES — V_пр = K₊₁[E][S] 1

Скорость обратной реакции — V_обр = К_-1[ES] 2

В стационарном состоянии, т.е. когда концентрация ES постоянна скорость прямого процесса равна скорости обратного — V_пр = V_обр или K₊₁[E][S] = К_-1[ES]

[E][S]/[ES] = K_-1/K₊₁ = К_s – константа диссоциации фермент-субстратного комплекса

Из уравнения материального баланса имеем: аналитическая концентрация фермента ([E_общее]) равна сумме концентраций свободного фермента ([E]) и фермент-субстратного комплекса ([ES]): — [E_общее] = [E] + [ES] 4

Скорость образования продукта реакции Р равна — V_{обр продукта} = К₊₂ [ES] 5

Из уравнения (3) имеем: [ES] = [E][S]/K_s, а из уравнения (4) — [E] = [E_общ ] – [ES], после

подстановки этого значения в предыдущее уравнение получаем:

После преобразования уравнения (6) относительно [ES] имеем:

Подставляя уравнение (7) в уравнение (5) получаем:

Очевидно, что скорость реакции образования продукта будет максимальной при данных условиях когда [ES] = [E_общ ], т.е. — K₊₂ [E_общ] = V_max

Вводя это значение в уравнение (8) получаем уравнение в виде:

которое называется уравнением Михаэлиса-Ментен, где:

· v – наблюдаемая скорость реакции при данной концентрации субстрата [S];

· K_S– константа диссоциации фермент-субстратного комплекса, моль/л;

· V_max– максимальная скорость реакции при полном насыщении фермента субстратом.

K_S и V_max – это константы, которые не зависят от концентрации субстрата, а характеризуют свойства фермента.

Теоретический график зависимости скорости ферментативной реакции (V) от концентрации субстрата [S] при постоянной концентрации фермента представляет собой график гиперболы.

Из уравнения Михаэлиса–Ментен следует, что при высокой концентрации субстрата и низком значении K_S скорость реакции является максимальной, (реакция нулевого порядка – участок (в) на графике). При низкой концентрации субстрата, напротив, скорость реакции оказывается пропорциональной концентрации субстрата в каждый данный момент (реакция первого порядка v = V_max∙[S] – участок (а) на графике). При средних значениях концентрации субстрата скорость реакции имеет смешанный порядок (участок (Б) на графике) и описывается уравнением Михаэлиса-Ментен.

Следует отметить, что уравнение Михаэлиса–Ментен в его классическом виде было выведено с использованием ряда допущений и, в частности, что образование продукта реакции идет быстро и необратимо. В реальной ферментативной кинетике как раз, как правило, образование продукта реакции процесс обратимый, т.е. более реальная схема ферментативного процесса должна учитывать как минимум 4 константы:

Поэтому были предприняты попытки усовершенствовать уравнение Михаэлиса-Ментен. В том же 1913 году несколько позднее была опубликована работа Бриггса и Холдейна, в которой было предложено уравнение, выведенное в результате анализа рассматриваемой схемы. Однако это уравнение Бриггса-Холдейна:

по сути мало отличается от уравнения Михаэлиса-Ментен. Отличие заключается в том, что вместо константы диссоциации фермент-субстратного комплекса К_s = K_-1/K₊₁ в уравнении используется более сложная константа названная позднее константой Михаэлиса К_m. Константа Михаэлиса (К_m) может быть представлена следующим уравнением:

Ферментативная активность. Каталитическая константа — число оборотов фермента. Максимальная скорость ферментативной реакции (Vmax). Константа диссоциации фермент-субстратного комплекса (Ks). Константа Михаэлиса-Ментен (Km).

Особенностью ферментативной кинетики является также то, что экспериментально измеряется не скорость ферментативной реакции, а активность фермента (ферментативная активность). Ранее в лекции №2 уже давалось определение ферментативной активности

Поскольку ферментативная активность не зависит от объема раствора, в котором протекает реакция (она пропорциональна концентрации фермента) ее выражают в специальных единицах: Если размерность скорости реакции – моль/ л·с, то размерность ферментативной активности моль субстрата, превращаемого в единицу времени. Используются следующие единицы активности ферментов:

• Катал. 1 кат = количеству фермента, которое превращает 1 моль субстрата за 1 сек.
• Нкат– нонакатал; 1нкат = 10 9 кат
• Международная единица ферментативой активности (Е) – количество фермента, превращающего 1 мкмоль субстрата в 1 мин.

Удельная активностьвыражается либо 1) количеством единиц (Е или кат, нкат) на 1 мг белка, либо 2) числом молей продукта образовавшегося за 1 минуту на 1 мг белка. Суммарная ферментативная активность определяется как произведение удельной активности на общее количество фермента.

Рассмотрим физический смысл констант уравнения Михаэлиса-Ментен: каталитической константы (К₂), максимальной скорости ферментативной реакции (V_max), константы диссоциации фермент-субстратного комплекса (K_s) и константы Михаэлиса-Ментен (K_m).

1. Константа скорости k₂ намного выше, чем константа той же, но некаталитической реакции. Константу k₂называют каталитической константой скорости ферментативной реакции Ее физический смысл заключается в том, что она соответствует числу молекул субстрата, превращаемых в продукт одной молекулой фермента за 1 сек. В связи с этим каталитическая константа еще называется «числом оборотов фермента».

Число оборотов фермента позволяет характеризовать активность ферментов, молекулярная масса которых известна. Чем больше число оборотов фермента, тем он более активен. В настоящее время около 2000 ферментов выделено в чистом виде и молекулярная масса определена у около 150 ферментов. Самым активным ферментом оказалась карбоангидраза, которая катализирует реакцию гидратации углекислого газа. Для нее число оборотов составляет 600.000 сек -1 . Амилаза, которая катализирует гидролиз крахмала, имеет число оборотов 18.300 сек -1 , число оборотов большей части ферментов определяется трех- или четырехзначным числом. Это свидетельствует о высокой активности ферментов. Если фермент не получен в чистом виде, то его активность определяется количеством молей преобразованного субстрата в одну минуту в расчете на 1 мг белка. Эта величина называется удельной активностью фермента. Очевидно, что чем чище ферментный препарат, тем выше окажется его удельная активность.

2. Максимальная скорость реакции (V_max) как видно из уравнения равна k₊₂[E_общ]. Очевидно, что эта величина является константой для данной реакции, проводимой с данной концентрацией фермента, т.е. эта величина также характеризует активность фермента. Если молекулярная масса фермента известна, то экспериментальное значение максимальной скорости реакции при данной молярной концентрации фермента легко может быть пересчитано в число оборотов.

3. Константа диссоциации фермент-субстратного комплекса (K_s)характеризует устойчивость фермент-субстратного комплекса. Чем меньше значение константы тем стабильнее фермент-субстратный комплекс.

4. Константа Михаэлиса (К_m)характеризуетсродствофермента к субстрату. Высокое сродство фермента к субстрату характеризуется низкой величинойК_m и наоборот. Величина К_m всегда численно больше чем величинаK_s. Константа Михаэлиса численно равна той концентрации субстрата [S], при которой ν достигает половины максимальной величины V_max (действительно, если v = V_max/2, то [S] / (К_m + [S]) = 1/2, отсюда К_m = [S]).

3. Стационарная кинетика ферментативных реакций. Уравнение Михаэлиса-Ментен. Физический смысл параметров уравнения Михаэлиса (K M, V max ). Значение параметра. — презентация

Презентация была опубликована 8 лет назад пользователемЕвгений Селиванцев

Похожие презентации

Презентация на тему: » 3. Стационарная кинетика ферментативных реакций. Уравнение Михаэлиса-Ментен. Физический смысл параметров уравнения Михаэлиса (K M, V max ). Значение параметра.» — Транскрипт:

1 3. Стационарная кинетика ферментативных реакций. Уравнение Михаэлиса-Ментен. Физический смысл параметров уравнения Михаэлиса (K M, V max ). Значение параметра k cat /K M. Порядок величин. Методы их определения Физико-химические основы биокатализа в иллюстрациях 3. Стационарная кинетика ферментативных реакций. Уравнение Михаэлиса-Ментен. Физический смысл параметров уравнения Михаэлиса (K M, V max ). Значение параметра k cat /K M. Порядок величин. Методы их определения

2 Стационарная кинетика ферментативных реакций. Уравнение Михаэлиса-Ментен v = E

3 Мауд Леонора Ментен 1879 – 1960, Канада биохимик и физиолог Леонор Михаэлис Берлин, Германия — Нью-Йорк, США биохимик и химик-органик

4 Интерпретация кинетических параметров для односубстратных реакций: механизм Михаэлиса-Ментен k cat V V

K S )» title=»Последующие модификации механизма Михаэлиса-Ментен 1) Механизм Бриггса-Холдейна (К M >K S )» > 5 Последующие модификации механизма Михаэлиса-Ментен 1) Механизм Бриггса-Холдейна (К M >K S ) K S )»> K S )»> K S )» title=»Последующие модификации механизма Михаэлиса-Ментен 1) Механизм Бриггса-Холдейна (К M >K S )»>

6 Промежуточное соединение, образующееся вслед за образованием ES: К M

7 Порядок величин параметров k cat, K M, k cat /K M – Константа k cat [cек -1 ] характеризует число оборотов ферментативной реакции. Как правило, ферменты без кофакторов (например, трипсин, химотрипсин) работают с медленной скоростью, их k cat от 10 2 cек -1. Ферменты, использующие для катализа реакции кофакторы (например, оксидоредуктазы), работают с большей эффективностью, их k cat до 10 7 cек -1. – Константы скорости связывания (k 1 ) в ферментативной кинетике обычно порядка с -1. Сродство субстрата к ферменту определяется величиной константы диссоциации (Kd) комплекса фермента с субстратом. Kd=k -1 /k 1 [моль/л=М] Чем ниже величина Kd, тем выше сродство субстрата к ферменту, то есть прочнее фермент-субстратный комплекс. Величина Kd может варьировать от М (неэффективное связывание субстрата с ферментом, таким образом, низкое сродство субстрата к ферменту), до М (высоко эффективное связывание, практически такое же прочное, как ковалентное). – Для механизма Бриггса-Холдейна отношение k cat /K M равно

8 Параметр k cat – число оборотов фермента, определяет максимальное число молекул субстрата, превращающихся в продукт одним активным центром в единицу времени -В том случае, когда имеется один фермент-субстратный комплекс и все стадии связывания достаточно быстрые, k cat – константа скорости первого порядка для превращения комплекса ES в комплекс ЕР. -В более сложных случаях k cat – функция всех констант скорости первого порядка. Например, для механизма, когда комплекс ЕР диссоциирует достаточно быстро, k cat =k 2 : -Для следующей схемы k cat является функцией констант k 2 и k 3 (k cat = k 2 k 3 /(k 2 +k 3 )): Однако, если одна из этих констант много меньше другой, k cat становится равной меньшей константе. Например, если k 3

>k 3, [ES΄]>>[ES], и [ES΄] вносит в вел» title=»K M =K S для простого механизма Михаэлиса-Ментен. В некоторых других случаях: K M = где [ES] – сумма концентраций всех фермент-содержащих форм. Для механизма действия химотрипсина: [ES΄] = [ES]k 2 /k 3 При k 2 >>k 3, [ES΄]>>[ES], и [ES΄] вносит в вел» > 9 K M =K S для простого механизма Михаэлиса-Ментен. В некоторых других случаях: K M = где [ES] – сумма концентраций всех фермент-содержащих форм. Для механизма действия химотрипсина: [ES΄] = [ES]k 2 /k 3 При k 2 >>k 3, [ES΄]>>[ES], и [ES΄] вносит в величину K M больший вклад, чем [ES], являясь преобладающей ферментсодержащей формой. K M меньше K S приблизительно в k 3 /k 2 раз: K MK S (k 3 /k 2 ) Физический смысл параметров уравнения Михаэлиса-Ментен Б) Величина K M >k 3, [ES΄]>>[ES], и [ES΄] вносит в вел»> >k 3, [ES΄]>>[ES], и [ES΄] вносит в величину K M больший вклад, чем [ES], являясь преобладающей ферментсодержащей формой. K M меньше K S приблизительно в k 3 /k 2 раз: K MK S (k 3 /k 2 ) Физический смысл параметров уравнения Михаэлиса-Ментен Б) Величина K M»> >k 3, [ES΄]>>[ES], и [ES΄] вносит в вел» title=»K M =K S для простого механизма Михаэлиса-Ментен. В некоторых других случаях: K M = где [ES] – сумма концентраций всех фермент-содержащих форм. Для механизма действия химотрипсина: [ES΄] = [ES]k 2 /k 3 При k 2 >>k 3, [ES΄]>>[ES], и [ES΄] вносит в вел»>

10 Физический смысл параметров уравнения Михаэлиса-Ментен В) Параметр k cat /K M Отношение k cat /K M не может превышать ни одну из констант скорости второго порядка для последовательности реакций, идущих в прямом направлении, и представляет собой нижний предел для константы скорости при связывании фермента с субстратом. Скорость реакции при низких концентрациях субстрата определяется уравнением v=(k cat /K M )[E] 0 [S], т.е. отношение k cat /K M представляет собой кажущуюся константу скорости второго порядка. Этот параметр не является истинной микроскопической константой, за исключением крайнего случая, когда реакция лимитируется столкновением фермента с субстратом. Параметр k cat /K M связывает скорость реакции с концентрацией свободного фермента, а не с его общей концентрацией. При низкой концентрации субстрата фермент находится преимущественно в свободном состоянии ([Е][Е] 0 ), и, следовательно, скорость реакции есть v=(k cat /K M )[E][S].

11 Графическое представление данных

12 1. График Лайнуивера-Берка

13 2. График Эдди-Хофсти v = V max — vK M /[S]

14 3. График зависимости V max от K M V max = v + K M v/[S]

Зависимость фермента от количества субстрата описывает ферментативная кинетика

Уравнения Михаэлиса-Ментен и Лайнуивера-Берка

Общую теорию ферментативной кинетики и зависимость активности фермента от субстрата.описали Л.Михаэлис и М.Л.Ментен, выразив его в своем уравнении. Бриггс и Холдейн усовершенствовали их уравнение, введя введя в него константу Михаэлиса (Km), определяемую экспериментально.

Уравнение Михаэлиса-Ментен показывает взаимосвязь максимально возможной скорости, реальной скорости реакции, константы Михаэлиса и концентрации субстрата. Так как пользоваться графиком, построенным в прямых координатах V и [S] для точных расчетов неудобно, то Г.Лайнуивер и Д.Бэрк преобразовали уравнение Бриггса–Холдейна в обратные координаты.

Уравнение Михаэлиса-Ментен

Уравнение Лайнуивера-Бэрка

На самом деле уравнение Михаэлиса-Ментен в данном виде предложили Бриггс и Холдейн, но в честь основоположников оно носит название Михаэлиса-Ментен.

Выделяют три основных решения уравнения Михаэлиса-Ментен:

1. Концентрация субстрата равна величине константы Михаэлиса ([S] = Km).
В этом случае, решая уравнение Михаэлиса-Ментен, получаем, что скорость реакции V будет равна половине максимальной Vmax.(V = ½ Vmax).

В математическом смысле Km соответствует концентрации субстрата при которой скорость реакции равна половине максимальной. Ее биологический смысл заключается в характеристике сродства фермента к субстрату, а именно: увеличение величины Кm означает снижение сродства фермента к субстрату.

2. Концентрация субстрата значительно больше Km ([S] >> Km). В этом случае величиной Km можно пренебречь, при решении получим, что скорость реакции максимальна (плато на графике).

3. Концентрация субстрата значительно меньше Km ([S]