Количественный флуориметрический анализ уравнение связи

Качественный и количественный флуориметрический анализ биомолекул

Качественный И КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ

флуориметрический АНАЛИЗ биомолекул

Спектры люминесценции, как и абсорбционные электронные спектры, используются для качественного и количественного анализа, в структурных исследованиях, для изучения физико–химических свойств сложных молекулярных систем. Люминесцентные методы анализа обладают высокой чувствительностью, в 1000 раз превышающей чувствительность большинства спектрофотометрических методов. Такая высокая чувствительность объясняется тем, что свечение молекул определяют непосредственно, причём его можно усилить или ослабить путём изменения интенсивности возбуждающего света. Особенность люминесцентных методов анализа обусловлена двумя основными факторами. Во-первых, существует относительно небольшое число веществ, обладающих люминесцентной способностью, по сравнению с поглощающими способностями. Во-вторых, в люминесцентном анализе используются две длины волны (возбуждения и испускания), тогда как, например, в спектрофотометрии анализ проводят при одной длине волны.

К недостаткам люминесцентных методов с точки зрения анализа веществ можно отнести зависимость люминесценции молекул от условий окружающей среды (температура, рН, вязкость и т. д.). Но этот недостаток делает люминесцентные методы перспективными для исследования физико–химических процессов в конденсированных средах. Природа таких процессов определяется из спектрально–люминесцентных характеристик молекул, которые носят название люминесцентных зондов. Таким образом, люминесцентные методы служат как для анализа самого вещества обладающего люминесцентной способностью (структурный анализ, качественный и количественный анализ), так и для изучения фотофизических процессов в конденсированных средах с использованием люминесцентных зондов.

Качественный флуориметрический анализ.

Качественный флуориметрический анализ позволяет обнаружить по спектрам флуоресценции (возбуждения и испускания) присутствие определённого вещества в анализируемой пробе. Для отождествления измеренного спектра флуоресценции со спектром какого-либо вещества определяют следующие параметры:

1) количество максимумов в спектре флуоресценции;

2) спектральное положение максимумов ( l max ) полос флуоресценции;

3) полуширину полос флуоресценции ( Dl 1/2 ) — разность между двумя длинами волн, при которых интенсивность флуоресценции составляет половину от максимальной.

При этом необходимо помнить, что экспериментальные условия, при которых проводятся люминесцентные измерения, существенным образом влияют на форму спектра флуоресценции. Так, в частности, все перечисленные выше параметры могут изменяться в зависимости от рН среды, ее температуры, полярности растворителя, концентрации исследуемого вещества и т. д.

1) Исследование спектров испускания флуоресценции.

По спектрам испускания флуоресценции можно проводить качественный анализ веществ. При измерениях спектров испускания люминесценции часто облегчается анализ спектров многокомпонентных систем, поскольку не все поглощающие вещества люминесцируют. Преимуществом флуоресцентного анализа смесей нескольких соединений также является возможность выделения флуоресценции отдельных компонентов путём изменения длины волны возбуждения флуоресценции. Незначительные изменения состояния вещества: агрегация, комплексообразование, изменение кислотно-основного равновесия и т. д. — обычно очень сильно сказываются на его люминесцентных свойствах. Поэтому измерение спектров люминесценции — один из основных методов изучения состояния вещества в биологических системах.

2) Исследование спектров возбуждения флуоресценции.

В связи с тем, что спектр возбуждения люминесценции какого-либо вещества совпадает по форме и положению максимумов со спектром его поглощения, измерение спектра возбуждения люминесценции позволяет установить характеристики спектра поглощения вещества, люминесцирующего в данной спектральной области. Это очень важно для идентификации люминесцирующих веществ. Например, совпадение спектра возбуждения люминесценции разбавленного раствора триптофана с его спектром поглощения, является лучшим доказательством того, что в данной спектральной области люминесцирует именно триптофан, а не примеси. Совпадение спектра возбуждения люминесценции для разбавленных растворов белка со спектром поглощения триптофана свидетельствует о том, что из многих аминокислот, входящих в состав белковых молекул, именно присутствие триптофана обеспечивает люминесценцию в исследуемой спектральной области.

Количественный флуориметрический анализ.

Между интенсивностью флуоресценции (Iф) вещества и его концентрацией (С) существует следующая зависимость:

I0 и I — интенсивности возбуждающего (падающего) и выходящего из образца светового пучка соответственно;

j кв . — квантовый выход люминесценции;

К — коэффициент, характеризующий чувствительность прибора для измерения люминесценции;

Т — пропускание образца при длине волны возбуждения люминесценции;

D — оптическая плотность образца при длине волны возбуждения люминесценции.

Из уравнения (1) видно, что величина Iф меняется в зависимости от D по экспоненциальному закону, и, следовательно, в общем случае между Iф и концентрацией вещества нет линейной зависимости, что осложняет использование измерения Iф для количественного анализа. Однако при небольших значениях D (D £ 0.01) в формуле (1) выражение в скобке можно разложить в ряд, и, ограничиваясь линейным членом, получаем равенство:

e — коэффициент молярной экстинкции люминесцирующего вещества при длине волны возбуждения люминесценции;

С — концентрация люминесцирующего вещества;

l — длина оптического пути возбуждающего света

Таким образом, в определённых пределах оптических плотностей Iф пропорциональна концентрации люминесцирующего вещества (С).

Для определения концентрации вещества по его люминесценции применяют графический метод, основанный на построении калибровочного графика в координатах Iф (C). Для построения калибровочного графика измеряют интенсивность люминесценции серии растворов данного вещества с известной концентрацией. Полученный график должен представлять собой прямую линию, тангенс угла наклона которой равен:

Измерив Iф исследуемого раствора, можно по калибровочному графику определить концентрацию вещества.

Существует несколько факторов, осложняющих точное измерение Iф или её применение для определения концентрации. Главные из них: «паразитный» («рассеянный») свет, экранировка возбуждающего света другими молекулами, реабсорбция исследуемыми молекулами или другими веществами, светорассеяние и неравномерное распределение молекул по объёму, миграция энергии и тушение флуоресценции.

«Паразитный», или «рассеянный» свет, включает в себя излучение источника в спектральной области регистрации флуоресценции, присутствующее в возбуждающем пучке вследствие несовершенства систем его выделения и попадающее на детектор, люминесценцию кюветы и растворителя.

Эффект экранировки возбуждающего света – поглощение части возбуждающего света посторонними молекулами, в результате чего уменьшается количество фотонов, поглощаемых исследуемым веществом, и тем самым снижается Iф.

Если известны значение D исследуемого вещества и общая оптическая плотность ( D об. ) образца при длине волны возбуждения, то регистрируемую величину интенсивности флуоресценции можно поправить на эффект экранировки:

I ф ’ — интенсивность флуоресценции при наличии экранировки.

Поправочный коэффициент, на который требуется умножить регистрируемую интенсивность флуоресценции вещества в смеси, находится из соотношения:

Реабсорбция заключается во вторичном поглощении квантов флуоресценции. Это явление может быть обусловлено исследуемыми молекулами (собственная реабсорбция) и в этом случае наблюдается лишь в области перекрывания спектра поглощения со спектром флуоресценции. При наличии собственной реабсорбции коротковолновая часть регистрируемого спектра флуоресценции будет заниженной, и к тому же его максимум окажется сдвинутым в длинноволновую область по сравнению с истинным спектром излучения. В многокомпонентных образцах кванты флуоресценции исследуемого вещества могут поглощаться молекулами других соединений, и это также сопровождается ослаблением свечения. Характер изменений формы спектра флуоресценции, в этом случае, полностью определяется формой спектра поглощения других веществ. Эффект реабсорбции увеличивается с возрастанием оптической плотности образца в области регистрации флуоресценции.

Так же, как и в случае эффекта экранировки, эффект реабсорбции можно учесть. Если известно значение оптической плотности исследуемого вещества при длине волны возбуждения флуоресценции ( D ) и значение оптической плотности образца при длине волны испускания флуоресценции ( D ф ) , то регистрируемую величину интенсивности флуоресценции можно поправить на эффект реабсорбции:

I ф ’’ — интенсивность флуоресценции при наличии реабсорбции.

Поправочный коэффициент, на который требуется умножить регистрируемую интенсивность флуоресценции вещества в смеси, находится из соотношения:

Особенности измерения флуоресценции биологических объектов.

1. Интенсивность люминесценции биологических объектов часто бывает довольно низкой. Это объясняется малой величиной квантовых выходов люминесценции, низкой концентрацией люминесцирующих веществ, экранирующим эффектом других компонентов. Измерение слабой люминесценции осложнено «паразитной» люминесценцией кювет, оптики, примесей и т. д. Для преодоления этих трудностей требуется аппаратура с повышенной чувствительностью, хорошая фокусировка света на образец, правильный выбор условий измерения и тщательный контроль на флуоресценцию кювет и растворителя.

2. При изучении люминесценции исследуемый образец подвергается воздействию интенсивного возбуждающего света, что может приводить к значительным изменениям фотохимически активных веществ в излучающей системе. Чем выше интенсивность возбуждающего света, тем лучше условия для измерения люминесценции, но зато тем сильнее разрушительное действие возбуждающего света. Выход из этого противоречия может быть найден при сочетании нескольких приёмов:

1) уменьшением яркости возбуждающего света на объекте за счёт увеличения площади пятна;

2) повышением чувствительности приёмника света и светосилы прибора;

3) увеличением скорости измерений;

4) понижением температуры.

Объект должен освещаться возбуждающим светом только в самый момент измерения, а в остальное время возбуждающий свет должен быть перекрыт специальной шторкой. В тех случаях, когда измерения люминесценции можно производить в одной точке, открывать возбуждающий свет следует только в момент отсчёта.

3. При измерениях люминесценции всегда приходиться считаться с сильным светорассеянием, свойственным биологическим объектам. Интенсивность возбуждающего света обычно на несколько порядков превышает интенсивность люминесценции, поэтому при сильном светорассеянии измерения люминесценции невозможны, даже если незначительная часть возбуждающего света пропускается в спектральной области люминесценции. Поэтому необходимо производить контроль на рассеянный свет, производя измерения с растворителем или же используя в качестве контроля какой-нибудь сильно рассеивающий, но не люминесцирующий объект (например, окись магния).

Светорассеяние не только затрудняет измерение люминесценции, но и осложняет анализ спектров вследствии увеличения оптического пути света в рассеивающем образце (как возбуждающего, так и света флуоресценции). Это приводит к появлению всех эффектов, характерных для объектов с высокой оптической плотностью: к возрастанию интенсивности люминесценции, к увеличению экранирующего эффекта и к усилению реабсорбции. Основными путями уменьшения нежелательных эффектов могут быть:

1) измерение в тонких слоях и при малых концентрациях;

2) выбор оптимальной области возбуждения;

3) уменьшение светорассеяния.

При замораживании светорассеяние сильно увеличивается. Поэтому при охлаждении образца наблюдается скачкообразное увеличение интенсивности люминесценции при температуре замерзания растворителя. Одновременно усиливается проявление всех других эффектов, связанных со светорассеянием.

4. Неравномерное распределение исследуемых молекул по объёму приводит к уменьшению оптической плотности (эффект «сита»). По этой причине неоднородные объекты флуоресцируют слабее однородных даже при условии одинаковой средней концентрации вещества. Исключить влияние этого эффекта иногда удаётся с помощью соответствующего подбора длин волн возбуждения.

Цель работы : практическое освоение аппаратуры и методов качественного и количественного флуориметрического анализа биомолекул и их смесей.

Приборы, принадлежности и реактивы

1) Спектрофлуориметр Hitachi MPF-4.

2) Спектрофотометр СФ-46.

3) Кювета для измерения флуоресценции (кварцевая кювета с двумя перпендикулярными прозрачными гранями и длиной оптического пути 1 см), кварцевые кюветы для измерения оптической плотности на спектрофотометре с длиной оптического пути 1 см.

4) Растворы исследуемых веществ.

1. Качественный флуориметрический анализ.

1. Ознакомиться (с помощью преподавателя) с устройством и принципом работы спектрофлуориметра.

Получить у преподавателя стандартный раствор исследуемого вещества с известной концентрацией (опытный образец) и растворитель (холостой раствор).

3. Измерить на спектрофлуориметре спектр испускания флуоресценции опытного образца.

Для этого на монохроматоре возбуждения флуоресценции выставить длину волны ( Excitation wavelength ), соответствующую наиболее длинноволновому максимуму в спектре поглощения исследуемого вещества. Установить щель монохроматора возбуждения ( Excitation Slit ) на значение 5 нм.

На монохроматоре испускания флуоресценции выставить длину волны ( Emission wavelength ) на 5-10 нм больше, чем выбранная длина волны возбуждения флуоресценции (установленная длина волны должна быть кратна 10). Установить щель монохроматора испускания ( Emission Slit ) на значение 5 нм.

Установить значение переключателя чувствительности ( Sample Sensitivity ) в положение «10».

Установить необходимую скорость регистрации спектра ( Scan Speed ).

Поместить кювету с исследуемым образцом в кюветное отделение прибора.

Открыть шторку прибора (положение «.»).

Замечание. Категорически запрещается открывать кюветное отделение прибора при открытой шторке!

Сканировать монохроматор испускания в диапазоне длин волн от выбранной начальной длины волны испускания до 800 нм.

Закрыть шторку прибора (положение « S »).

4. На полученном спектре найти полосу испускания для которой наблюдается наибольшая интенсивность флуоресценции. Определить в ней значение интенсивности и спектрального положения максимума. Полученное значение интенсивности флуоресценции должно лежать в интервале от 0,3 до 1,0 В по шкале регистрирующего устройства. При значениях, отличающихся от этого диапазона, необходимо подобрать соответствующее положение переключателя Sample Sensitivity и заново отсканировать спектр.

5. Измерить на спектрофлуориметре спектр возбуждения флуоресценции опытного образца.

Для этого на монохроматоре испускания флуоресценции выставить длину волны ( Emission wavelength ), соответствующую наиболее интенсивному максимуму в спектре испускания флуоресценции исследуемого вещества. Установить щель монохроматора испускания ( Emission Slit ) на значение 5 нм.

На монохроматоре возбуждения выставить длину волны ( Excitation wavelength ) 200 нм. Установить щель монохроматора возбуждения ( Excitation Slit ) на значение 5 нм.

Установить значение переключателя чувствительности ( Sample Sensitivity ) в положение, подобранное при регистрации спектра испускания.

Установить необходимую скорость регистрации спектра ( Scan Speed ).

Открыть шторку прибора (положение «.»).

Замечание. Категорически запрещается открывать кюветное отделение прибора при открытой шторке!

Сканировать монохроматор возбуждения от 200 нм до длины волны, которая будет на 10 нм меньше, чем выбранная длина волны испускания флуоресценции.

Закрыть шторку прибора (положение « S »).

Извлечь кювету с опытным образцом из кюветного отделения прибора.

6. Измерить спектры возбуждения и испускания флуоресценции для холостого раствора при тех же условиях, что и опытный раствор.

7. Найти разность значений интенсивности флуоресценции опытного и холостого раствора для спектров возбуждения и испускания флуоресценции исследуемого вещества при каждой длине волны.

8. Нормировать полученные разностные спектры. Для этого необходимо определить в каждом спектре максимальное значение интенсивности флуоресценции. Затем разделить значения интенсивности флуоресценции данного спектра при каждой длине волны на интенсивность его максимального значения.

9. На рисунке 1 построить в одной системе координат нормированные спектры возбуждения и испускания флуоресценции исследуемого вещества. Сделать все необходимые обозначения и подписи.

10. На полученных спектрах определить количество максимумов, интенсивность максимумов, спектральное положение максимумов, полуширину полос флуоресценции, определить «стоксов» сдвиг для исследуемого образца в данном растворителе.

Сформулировать и записать выводы по данному заданию.

2. Исследование спектра испускания флуоресценции при различных длинах волн возбуждения.

Для исследования использовать опытный образец из задания 1. На спектрофлуориметре измерить спектры испускания флуоресценции опытного образца при длинах волн возбуждения, соответствующих максимумам в спектре возбуждения исследуемого соединения (использовать полученные результаты и условия измерения из задания 1). Определить на полученных спектрах интенсивность и длину волны в максимумах полос испускания. Данные занести в таблицу 1.

Примечание. l возб — длина волны возбуждения флуоресценции, l исп. , I исп. — длина волны испускания и интенсивность флуоресценции опытного образца.

Сделать предположение о количестве люминесцирующих компонентов в исследуемом образце. Сформулировать и записать выводы по данному заданию.

3. Количественный флуориметрический анализ.

1. Получить у преподавателя исходный раствор исследуемого вещества с известной концентрацией (маточный раствор), раствор того же вещества с неизвестной концентрацией (задача) и растворитель.

Из маточного раствора и растворителя приготовить серию разведений с концентрациями в диапазоне от исходной до 0,01 мкМ (не менее 9 растворов с разными концентрациями равномерно захватывающими этот диапазон). Используя данные полученные в задании 1, выбрать аналитические длины волн возбуждения и испускания флуоресценции для исследуемого вещества. Длины волн должны быть выбраны таким образом, чтобы они не попадали на область перекрывания этих спектров. Измерить интенсивность флуоресценции приготовленных разведений, задачи и растворителя при фиксированных длинах волн возбуждения и испускания.

Для этого на монохроматоре возбуждения флуоресценции ( Excitation wavelength ) выставить выбранную аналитическую длину волны возбуждения флуоресценции. Установить щель монохроматора возбуждения ( Excitation Slit ) на значение 10 нм.

На монохроматоре испускания флуоресценции ( Emission wavelength ) выставить выбранную аналитическую длину волны испускания флуоресценции. Установить щель монохроматора испускания ( Emission Slit ) на значение 10 нм.

Установить значение переключателя чувствительности ( Sample Sensitivity ) в положение «30».

Поместить кювету с исследуемым образцом в кюветное отделение прибора.

Открыть шторку прибора (положение «.»).

Замечание. Категорически запрещается открывать кюветное отделение прибора при открытой шторке!

Регистрировать интенсивность флуоресценции в течение одной минуты.

Закрыть шторку прибора (положение « S »).

На полученной кинетике измерить среднее значение интенсивности флуоресценции образца. Если среднее значение интенсивности флуоресценции получается больше 1 В по шкале регистрирующего устройства, то повторить регистрацию при положении переключателя чувствительности ( Sample Sensitivity ) равном «3» (уменьшение чувствительности в 10 раз).

Определить среднее значение и стандартное отклонение интенсивности флуоресценции для каждого образца (опытный раствор) и растворителя (холостой раствор). Найти разность значений между каждым опытным и холостым раствором. Данные занести в таблицу 2.

Примечание. С — концентрация исследуемого вещества, I ср. и s — средняя интенсивность и стандартное отклонение интенсивности флуоресценции образца.

I – разность интенсивностей флуоресценции опытного и холостого раствора.

На рисунке 2 построить зависимость интенсивности флуоресценции ( I ) от концентрации ( C ) исследуемого вещества. Около каждой точки указать разброс экспериментальных данных ( s ). Сделать все необходимые обозначения и подписи. Найти на графике линейный участок зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации. Применить к этому участку метод линейной регрессии. Найти уравнение регрессионной кривой. Используя найденное уравнение, определить неизвестную концентрацию исследуемого вещества (задача). Определить коэффициент чувствительности и порог чувствительности флуориметрического определения данного вещества. Сформулировать и записать выводы по данному заданию.

4. Количественный флуориметрический анализ при наличии эффектов внутреннего фильтра.

Флуориметрический анализ воды: принцип работы, определение величин, чувствительность

Для анализа содержания химических веществ в растворах можно использовать такое свойство веществ, как флуоресценцию. Облучение некоторых веществ излучением с фиксированной длиной волны приводит к тому, что они начинают светиться. Измерение интенсивности и других параметров такого свечения позволяет судить о концентрации и составе веществ в исследуемой пробе.

Общие сведения о флуориметрии

Кто открыл люминесцентный метод?

Первые упоминания специфичного свечения некоторых растворов датируются работами испанского ботаника Н. Монардеса от 1577 года. Дальнейшее изучение этого явления и первые предположения о возможности его использования произошли на три века позже. Флуоресценцию соединений хинина наблюдал в 1852 физик Джордж Стокс, также известный по своему вкладу в такие области физики, как гидродинамика и оптика. Ему также принадлежит предположение о возможности использования этого метода для химического анализа. Первым практическим применением флуоресцентного метода анализа стало опубликованное в 1867 году Гоппельшредером исследование ионов Al III + .

Интересно, что наблюдать явление флуоресценции хинина можно и в быту – достаточно осветить бутылку тоника Schweppes ультрафиолетовым светом и содержащейся в нём хинин начнёт светиться.

Принципы работы и сущность

Принцип явления флуоресценции заключается в способности электронов переходить между энергетическими уровнями под воздействием возбуждающего излучения. Поскольку положение электрона на определенном энергетическом уровне в атоме – равновесное состояние, перевод или возбуждение электрона приводит к нестабильности системы. Эта нестабильность проходит со временем – возбужденный электрон возвращается в свое нормальное состояние.

Разница энергии между возбуждённым и основным состояниями электрона не может исчезать бесследно в связи с законом сохранения энергии, поэтому она расходуется на процесс релаксации. Та часть энергии, которая не была на него затрачена, испускается в виде фотона с соответствующей энергией. Испускание такого фотона – основной механизм флуоресценции. Излучение фотона происходит в течение сотых и тысячных долей секунды.

Флуоресценция – не единственный вид люминисценции. Фосфоресценция предполагает гораздо более длительные периоды свечения, что связано с механизмом возбуждения электронов вещества и некоторыми квантовыми явлениями. Это сильно отличает феномены фосфоресценции и флуоресценции друг от друга. Аналитическая значимость фосфоресценции достаточно низка, но вещества, обладающие такими свойствами, часто используют в различных изделиях: стрелки и циферблаты часов, приборов, стрелки аварийного выхода, игрушки.

Количественная и качественная флуориметрия

Флуоресцентный анализ достаточно точен, но есть нюансы. Метод подвержен влиянию внешних условий: рН среды, температуры, вязкости и других параметров среды. Из-за этого, количественная разновидность этого метода непроста в применении. Его точность бывает недостаточной при исследовании проб сложного состава, подверженных деструкции, чересчур вязких проб и других. В дополнение к этому, обратим внимание на мешающие количественной флуориметрии явления: экранировка молекул исследуемого вещества другими соединениями, паразитный свет, реабсорбция света исследуемыми молекулами, неравномерность распределения молекул по объёму пробы. Тем не менее, этот метод анализа незаменим при работе с биологическими соединениями, такими как белки и аминокислоты. Современное оборудование, используемое для флуориметрии, позволяет нивелировать большинство недостатков этого подхода.

Способность исследуемых веществ к люминисценции также может меняться при смене дисперсности, что позволяет проводить довольно точный анализ, если известны исходные спектры. Качественная флуориметрия использует информацию о спектрах испускания исследуемых веществ, но поскольку не все химические соединения способны испускать фотоны, именно этот метод используется в качестве вспомогательного при спектрофотометрии многокомпонентных систем. Ряд недостатков качественной флуориметрии не способен перевесить её достоинства, поэтому этот метод анализа предпочтителен в медицинских, биохимических и биологических исследованиях.

Величины измерения и погрешности

Главным достоинством флуориметрии следует считать её крайне высокую точность. Считается, что методы анализа, основанные на флуоресцентных свойствах веществ, точнее других спектрофотометрических методов в тысячу раз. Определённую погрешность в эти измерения вносят различные эффекты, упомянутые выше: экранирование, паразитный свет, реабсорбция и другие явления межмолекулярного и внутримолекулярного взаимодействия. Использование флуориметрии требует постройки калибровочного графика при помощи растворов исследуемого вещества нужной концентрации, а также умения подбора поправочных коэффициентов для учёта различных побочных явлений. Современные приборы чаще всего имеют ПО со встроенными опциями для автоматического использования различных уточняющих коэффициентов.

Обзор основных типов приборов

Фильтрационный флуориметр

Принципиальное устройство этого прибора включает в себя:

• Источник излучения. Чаще всего для флуориметров возбуждающим излучателем выступает лазер, реже – ксеноновая газоразрядная или ртутная лампа, либо светодиоды и светодиодные матрицы.
• Первичный фильтр длины волн. Этот компонент устраняет ультрафиолет, не позволяет превысить требуемую интенсивность возбуждающего излучения.
• Вторичный фильтр. Пропускает флуоресценцию в нужные исследователю области длины волн. Блокирует рассеянный пробой возбуждающий пучок.
• Детектор. Включает в себя фотоумножители для преображения светового сигнала в электрический.

Как правило, детектор излучения помещается под углом в 90 градусов к источнику возбуждающего излучения для устранения возможности попадания возбуждающего излучения на детектор. Спектральные фильтры применяются в качестве дополнительной меры предосторожности. Они позволяют вторичному возбуждающему излучению не воздействовать на детектор, не влиять на результаты анализа.

Спектрофлуориметр

Спектрофлуориметр отличается от фильтрующего в основном конструкцией светофильтров. Вместо спектральных фильтров в такие приборы устанавливаются различные монохроматоры: призмы или дифракционные решетки. Параметры дифракционной решётки (ширина щелей или величина ячеек решётки) оказывают непосредственное влияние на точность, чувствительность и разрешение анализа. Чаще всего решётки с меньшими ячейками показывают более высокую разрешающую способность и точность, но при этом заметно менее чувствительны к прохождению излучения через меньшие зазоры. В остальном конструкция спектрофлуориметра не отличается от фильтрующего флуориметра.

Флуориметрия и исследование воды

Какую воду можно исследовать?

Специфика метода диктует необходимость тщательной пробоподготовки для анализа. Любые твердые примеси из анализируемой воды должны быть удалены, поскольку они оказывают заметное влияние на флуоресцентные свойства вещества. Также, кислород выступает сильным гасителем флуоресценции, поэтому он должен быть максимально удалён из исследуемого раствора. Ещё один важный фактор, который необходимо учитывать до проведения флуориметрии – это то, что не все вещества способны к флуоресценции в воде. Поэтому следует знать свойства искомого вещества в пробе воды. Также, следует учитывать склонность некоторых флуоресцентных веществ к фоторазложению, то есть, следует хранить исследуемые образцы в темноте.

Что можно узнать, применяя флуориметрию?

Исследование проб воды при помощи флуориметрии позволяет с высокой точностью определять содержание и количество тех веществ, которые имеют свойство флуоресцировать в воде. Вместе с этим, высокая чувствительность метода ко внешним условиям и состоянию исследуемого вещества делает этот метод незаменимым для контроля изменений состояний веществ в биологических системах. Также, высокая чувствительность метода позволяет использовать флуориметрию в качестве дополнительного метода исследования для подтверждения или уточнения результатов спектрофотометрических исследований.

Как происходит определение показателей?

Общий принцип определения показателей пробы заключается в измерении отклика детектора при заданной длине волны и интенсивности возбуждающего излучения. В конечном результате, при исследовании методом флуориметрии измеряется величина интенсивности флуоресценции, связанная с концентрацией обнаруживаемого вещества. Эта зависимость носит экспоненциальный характер, что требует построения калибровочного графика. Этот график обычно строится с применением растворов искомого вещества с известными концентрациями и представляет собой прямую, тангенс угла наклона которой описывается следующим образом:

tga = 2.3 × I0 × K × jкв. × e × l,

где I0 – интенсивность возбуждающего излучения,

K – коэффициент чувствительности прибора,

jкв. – квантовый выход люминисценции,

e – коэффициент молярной экстинкции исследуемого вещества при заданной возбуждающей длине волны.

Экономическая целесообразность метода

Флуориметры достаточно дороги в производстве и имеют высокую стоимость – порядка 35-40 тысяч долларов за базовые модели. Несмотря на определенные ограничения, накладываемые особенностями метода измерения, крайне высокая чувствительность приборов, а также и их способность измерять концентрации строго определённых веществ (т.е. высокая селективность) приводят к тому, что альтернатив им попросту нет.

Флуориметры служат важнейшими аналитическими инструментами на многих производствах – их экономическая целесообразность неоспорима. Флуориметры могут применяться для контроля сточных вод на производствах, обеспечивая высокую точность и селективность измерений при должной водоподготовке. Нет дополнительных расходов на плановые мероприятия – все действия обусловлены знанием.

Заключение

Флуориметрия – чувствительный и высокоселективный метод анализа. При этом он имеет ряд недостатков. Эти недостатки нивелируются современным оборудованием, но могут помешать проводить исследования с необходимой точностью.

• заметная зависимость от условий окружающей среды;
• строгие требования к исследуемой пробе;
• невозможность определения некоторых веществ, не способных к флуоресценции.

• высокая точность;
• сравнительная простота пробоподготовки (при условии наличия подходящего оборудования);
• возможность контроля биохимических и биологических процессов.

Наибольшее применение флуориметрия находит в качестве: вспомогательного метода (для других спектрофотометрических видов анализа); метода контроля процессов, носящих биохимическую природу. Примерами лабораторий, в которых необходима установка флуориметров будут биохимические и фармакологические учреждения, то есть, те лаборатории, где точность анализа и чистота веществ будет иметь первостепенное значение.

Флуометрический анализ

Автор работы: Пользователь скрыл имя, 09 Декабря 2014 в 18:25, курсовая работа

Краткое описание

Вопросы стандартизации и контроля качества лекарственных средств продолжают оставаться актуальными направлениями развития фармацевтического анализа. Это обусловлено, в том числе, общим увеличением числа лекарственных средств, введением в качестве лекарственных, новых биологически активных веществ, принадлежащих к различным классам природных и синтетических соединений.
Проблема ухудшения качества продукции отечественного фармацевтического рынка неоднократно обсуждался на заседаниях правительства РФ и связывается специалистами с тремя основными факторами:
Нелегальный ввоз лекарственных препаратов и биологически активных добавок из-за рубежа.
Несовершенство законодательной базы регулирующей оборот лекарственных средств на территории страны.
Высокие технические возможности нелегального производства препаратов — фальсификатов и ограниченные аналитические возможности выявления подделки лекарственных средств.

Содержание

Введение…………………………………………………………………………..3
Глава I Теоретические основы флуориметрического анализа………………. 6
Понятие и сущность флуориметрии…………………………………………6
Физическая сторона флуориметрического анализа………………………..9
Нелинейная флуориметрия сложных органических веществ…………….11
Обратные задачи флуориметрии насыщения……………………………. 16
Приборы для проведения флуориметрического метода в фармацевтическом анализе………………………………………………….19
Глава II Применение флуориметрического анализа к некоторым лекарственным веществам………………………………………………………20
Определение содержания рибофлавина (витамина В2) методом флуориметрии………………………………………………………………..20
2.2 Флуориметрическое определение содержания родамина………………. 22
2.3 Флуориметрическое определение кверцетина в лекарственных формах
рутина………………………………………………………………………..24
2.4 Флуориметрическое определение 2-амино-4-окси-6- птеридинкарбоновой
кислоты в лекарственных формах фолиевой кислоты……………………25
Заключение………………………………………………………………………26
Список используемой литературы……………………………………………..27

Вложенные файлы: 1 файл

курсовая фх.doc

Глава I Теоретические основы флуориметрического анализа………………. 6

1. Понятие и сущность флуориметрии…………………………………………6
2. Физическая сторона флуориметрического анализа………………………..9
3. Нелинейная флуориметрия сложных органических веществ…………….11
4. Обратные задачи флуориметрии насыщения……………………………. 16
5. Приборы для проведения флуориметрического метода в фармацевтическом анализе………………………………………………….19

Глава II Применение флуориметрического анализа к некоторым лекарственным веществам……………………………………………………… 20

1. Определение содержания рибофлавина (витамина В2) методом флуориметрии……………………………………………… ………………..20

2.2 Флуориметрическое определение содержания родамина………………. 22

2.3 Флуориметрическое определение кверцетина в лекарственных формах

2.4 Флуориметрическое определение 2-амино-4-окси-6- птеридинкарбоновой

кислоты в лекарственных формах фолиевой кислоты……………………25

Список используемой литературы…………………………………………….. 27

Вопросы стандартизации и контроля качества лекарственных средств продолжают оставаться актуальными направлениями развития фармацевтического анализа. Это обусловлено, в том числе, общим увеличением числа лекарственных средств, введением в качестве лекарственных, новых биологически активных веществ, принадлежащих к различным классам природных и синтетических соединений.

Проблема ухудшения качества продукции отечественного фармацевтического рынка неоднократно обсуждался на заседаниях правительства РФ и связывается специалистами с тремя основными факторами:

1. Нелегальный ввоз лекарственных препаратов и биологически активных добавок из-за рубежа.
2. Несовершенство законодательной базы регулирующей оборот лекарственных средств на территории страны.
3. Высокие технические возможности нелегального производства препаратов — фальсификатов и ограниченные аналитические возможности выявления подделки лекарственных средств. [1]

Поэтому совершенствование способов контроля качества при производстве и особенно количественное определение при клиническом использовании может считаться одной из наиболее важных задач современной клинической фармации.

Разработка методик контроля качества лекарственных средств базируется на использовании новейших аналитических методов, таких как ВЭЖХ и ГЖХ, ИК и ЯМР-спектроскопия, масс-спектрометрия. Не теряют своей значимости ТСХ, спектрофотометрия. Однако условием испытания подлинности остается идентификация ионов и функциональных групп органических веществ, входящих в структуру молекул, посредством их химического анализа. Химия развивается столь быстро, что даже при наличии экспрессных инструментальных, химические методы не только сохраняют свое значение, но и продолжают развиваться. [4]

Преимущества, которые дает флуориметрия в анализе лекарственных средств в различных объектах, способствовали введению этого метода в перечень фармакопейных.

В функциональном анализе фармацевтических соединений предполагается обычно, что молекулу органического соединения можно рассматривать как сумму практически независимых функциональных групп и, следовательно, принимается, что физические и химические свойства соединения определяются свойствами этих функциональных групп. При проведении идентификации сложных молекул, несомненно, следует учитывать взаимное влияние функциональных групп, которое может вызвать неожиданное изменение свойств этих групп, а также отклонения наблюдаемых свойств от теоретически ожидаемых.

Методы флуоресцентного анализа имеют важное самостоятельное значение особенно в промышленности при получении фармацевтических препаратов, так как проведение функционального анализа — важная и часто необходимая стадия при определении качественного состава сложных смесей. [13]

Учитывая вышесказанное, нами показан поиск теоретически обоснованного подхода к разработке реакций флуоресцентного определения. В основу подхода была положена идея получения конкретного производного, флуоресцирующего в видимой области спектра. Результатом исследования стали флуоресцентные реакции и разработанные на их основе методики обнаружения и количественного определения примесей в лекарственных препаратах.

Чистота — одно из основных требований, предъявляемых к лекарственным препаратам, обуславливающим как возможность получения чистого соединения, так и его стабильность. Это требование непрерывно растет по отношению к лекарственным препаратам. Содержание основного вещества в настоящее время пока составляет не более 97-98%, поэтому как методы очистки, так и методы контроля очень важны при оценке качества лекарственных средств. [36]

Глава I Теоретические основы флуориметрического анализа

Флуориметрия (ее называют также люминесцентным анализом) – это определение концентраций вещества в соответствии с интенсивностью флуоресценции, которая возникает в процессе облучения изучаемого вещества с помощью ультрафиолетовых лучей. [8, 9]

При наличии соответствующих условий таким методом можно детектировать присутствие даже ничтожных количеств. Процедуры флуорометрии делят на макроанализ, когда исследования производятся невооруженным глазом, и на микроанализ, когда определения осуществляют посредством микроскопа и других приборов. В качестве метода диагностики и спектрального анализа в отношении сложной органики люминесцентный анализ имеет достоинства, способствующие его чрезвычайной привлекательности. [5]

В первую очередь потому, что многие из органических соединений имеют способность флуоресцировать в случаях оптического возбуждения при квантовом выходе, который можно полагать достаточным для достоверного и уверенного решения задач диагностики. Именно поэтому флуориметрия считается одним из наиболее чувствительных методов в оптической спектроскопии. [6]

Флуориметрия — один из эмиссионных аналитических методов и относится к фотометрическим методам. Позволяет обнаруживать микро- и нанограммовые количества анализируемых веществ с достаточной точностью, что используется в анализе примесей. Наличие двух характерных максимумов (в спектре возбуждения и в спектре излучения флуоресценции) увеличивает избирательность определения. Изменение цвета и выхода флуоресценции при смене растворителя и рН используется для идентификации и исследования структурных особенностей молекул.

Во флуоресцентном анализе растворов обычно используются следующие свойства:

а) способность к флуоресценции самого соединения в зависимости от свойств растворителя ( рН, диэлектрическая проницаемость);

б) возникновение или изменение флуоресцентных свойств в присутствии катионов металло в (хелатообразование);

в) образование флуоресцирующих ассоциатов;

г) возникновение или изменении флуоресценции флуорогенного метчика при присоединении к нему определяемого соединения;

д) возникновение флуоресценции в процессе взаимодействия исследуемого соединения и реагента в результате образования нового соединения с высоко поглощающей устойчивой структурой;

е) возникновение флуоресценции в результате присоединения к исследуемому соединению «флуорофора» — группировки, повышающей поглощающую и излучающую способность;

ж) возникновение флуоресценции в результате электронных перегруппировок внутри молекулы без изменения ее формулы (окислительно- восстановительные процессы);

з) «тушение» собственной флуоресценции одного вещества в присутствии друг. [7, 30]

Тем не менее, флуоресцентный метод имеет ряд недостатков, основными из которых можно считать низкий порог концентрационного тушения и необходимость использования стандартных образцов при проведении анализа флуоресцирующих соединений. Эти недостатки существенно ограничивают использование флуориметрии в фармацевтической и биофармацевтической практике, не позволяя проводить флуоресцентные определения в растворах веществ, имеющих концентрацию более 15-20 мкг/мл. Необходимость разбавления анализируемых проб приводит к увеличению систематических ошибок анализа и заметно снижает экспрессность методик. [2]

Одна из главных проблем связана с растворителем пробы. Нередко случается, что некоторая методика вполне пригодна для определения данного соединения, однако проба оказывается нерастворимой в рекомендуемом растворителе. В настоящее время известно, что титрование можно проводить во многих органических растворителях. Если рекомендуемый в методе растворитель не растворяет пробу, то всегда удается подобрать другой растворитель, в котором можно провести титрование. При выборе растворителя следует учитывать реакционную способность проб. Например, ангидриды кислот или хлорангидриды реагируют со многими растворителями, однако, можно подобрать растворители, которые с ними не реагируют и в которых можно провести титрование. К таким растворителям относятся диметилформамид, ацетон и хлорбензол. Кроме того, некоторые растворители могут оказывать влияние на аналитическую реакцию. Поэтому необходимо подобрать такие растворители, в которых растворяются и проба, и реактив и возможно протекание химического процесса.

Применение неводных высококипящих растворителей позволяет ускорять особенно медленные аналитические реакции. [18, 35]

1. Физическая сторона флуориметрического анализа

Поглощение света, безусловно, является необходимым условием флуоресценции, но в тех случаях, когда поглощение раствора слишком высоко, световой поток не проходит через него и не может служить источником возбуждения. Как известно, при высоких концентрациях участки раствора, расположенные ближе к источнику возбуждения, поглощают большее количество света, чем дальше расположенные. Интенсивность освещения раствора и, соответственно, излучение прогрессивно убывают по мере удаления от источника (внутреннее экранирование).

Процесс флуоресценции веществ подчиняется законам светопоглощения, как и все оптические методы анализа: интенсивность проходящего через раствор вещества светового потока уменьшается согласно закону Бера — Ламберта: I = I0 -kcl,

где: I — интенсивность светового потока, проходящего через раствор;

Iо- интенсивность падающего света;

К — коэффициент поглощения раствора;

С — концентрация вещества;

l — длина пути светового потока в поглощающем растворе вещества.

Интенсивность флуоресценции (испускаемой во всех направлениях) зависит от количества поглощаемого флуоресцирующим объектом света и квантового выхода флуоресценции :

где: F — общая интенсивность флуоресценции;

D — оптическая плотность раствора.

При малых величинах D« 0,1 формула имеет следующий вид:

F = 10 ф(1 — (1 — D + D2/2′ — D3/3′ In), или F = I0*D. Таким образом, зависимость F от D (с учетом значения квантового выхода и интенсивности возбуждающего света) является линейной, что более удобно для экспериментальных исследований. Переход к линейной зависимости позволяет рассчитывать концентрацию флуорофоров по законам светопоглощения.

Однако необходимо вычислить минимальное значения оптической плотности раствора D0, при которых ошибка измерения интенсивности флуоресценции не превышает некоторой заданной величины.

Как правило, линейная зависимость флуоресценции от концентрации раствора наблюдается до тех пор, пока количество флуоресцирующего вещества не становится настолько большим, что раствор начинает поглощать значительное количество возбуждающего света. Боуен и Уокс показали, что для получения линейной зависимости раствор должен поглощать менее 5% возбуждающего света. Поэтому Dn = 2,0×0,05 = 0,1, то есть предел линейной зависимости флуоресценции от концентрации определяется достижением оптической плотности D = 0,1.

Поскольку D = KCL, то одной и той же оптической плотности могут соответствовать различные концентрации в зависимости от толщины поглощающего слоя. Следовательно, использование кювет с различной толщиной рабочего слоя позволяет применять флуориметрию для измерения высоких концентраций без предварительного разбавления проб. При практическом использовании этого приема выявлена закономерность, связывающая изменения толщины рабочего слоя кюветы и предела обнаружения методики: при уменьшении рабочего слоя в 2 раза верхний пределе линейности калибровочного графика увеличивается в среднем в 1,4 раза.

Измерения отношения интенсивности флуоресценции вещества к интенсивности облучающего пробу светового потока (F/I0) позволяет определять величину, подобную оптической плотности в спектрофотометрии. Эта величина зависит только от концентрации исследуемых веществ при использовании стандартных кювет, что позволяет стандартизовать измерения флуоресценции и избавится от необходимости использования стандартных растворов.