Осаждение белков сульфатом аммония реакция уравнение
Реакции осаждения белков
4. Реакции осаждения белков
Белки в растворе и соответственно в организме сохраняются в нативном состоянии за счет факторов устойчивости, к которым относятся заряд белковой молекулы и гидратная оболочка вокруг нее. Удаление этих факторов приводит к склеиванию молекул белков и выпадению их в осадок. Осаждение белков может быть обратимым и необратимым в зависимости от реактивов и условий реакции. В клинической лабораторной практике реакции осаждения используют для выделения альбуминовой и глобулиновой фракций белков плазмы крови, количественной характеристики их устойчивости в плазме, обнаружения белков в биологических жидкостях и освобождения от них с целью получения без белкового раствора.
Под действием факторов осаждения белки выпадают в осадок, но после прекращения действия (удаления) этих факторов белки вновь переходят в растворимое состояние и приобретают свои нативные свойства. Одним из видов обратимого осаждения белков является высаливание.
Высаливание. Насыщенным раствором сульфата аммония осаждается альбуминовая фракция белков, полунасыщенным раствором — глобулиновая фракция.
Сущность реакции заключается в дегидратации молекул белка.
1) неразведенный яичный белок;
2) насыщенный раствор сульфата аммония;
3) NaOH, 10% раствор,
4) CuSO 4 , 1% раствор;
5) дистиллированная вода;
6) сульфат аммония в порошке.
Ход определения. В пробирку наливают 30 капель неразведенного яичного белка и добавляют равное количество насыщенного раствора сульфата аммония. Содержимое пробирки перемешивают. Получают полунасыщенный раствор сульфата аммония, при этом глобулиновая фракция осаждается, а альбуминовая остается в растворе. Последнюю отфильтровывают, затем смешивают с порошком сульфата аммония до тех пор пока не прекратится растворение соли, при этом выпадает осадок — глобулины.
Необратимое осаждение белков.
Необратимое осаждение белков связано с глубокими нарушениями структуры белков (вторичной и третичной) и потерей ими нативных свойств. Такие изменения белков можно вызвать кипячением, действием концентрированных растворов минеральных и органических кислот, солями тяжелых металлов.
Осаждение при кипячении.
Белки являются термолабильными соединениями и при нагревании свыше 50-60 градусов С денатурируются. Сущность тепловой денатурации заключается в разрушении гидратной оболочки, разрыве стабилизирующих белковую глобулу связей и развертывании белковой молекулы. Наиболее полное и быстрое осаждение происходит в изоэлектрической точке (когда заряд молекулы равен нулю), поскольку частицы белка при этом наименее устойчивы. Белки, обладающие кислыми свойствами, осаждаются в слабокислой среде, а белки с основными свойствами — в слабощелочной. В сильнокислых или сильнощелочных растворах денатурированный при нагревании белок в осадок не выпадает, т.к. его частицы перезаряжаются и несут в первом случае положительный, а во втором — отрицательный заряд, что повышает их устойчивость в растворе.
1) яичный белок, 1% раствор;
2) уксусная кислота, 1% и 10% растворы;
3) NaOH, 10% раствор.
Ход определения. В 4 пронумерованные пробирки приливают по 10 капель раствора яичного белка. Затем 1-ю пробирку нагревают до кипячения, при этом раствор мутнеет, но т.к. частицы денатурированного белка несут заряд, они в осадок не выпадают. Это связано с тем, что яичный белок имеет кислые свойства (его изоэлектрическая точка 4,8) и в нейтральной среде заряжен отрицательно; во вторую пробирку добавляют 1 каплю 1% раствора уксусной кислоты и нагревают до кипячения. Белок выпадает в осадок, т.к. его раствор приближается к изоэлектрической точке и белок теряет заряд (один из факторов устойчивости белка в растворе); в 3-ю пробирку добавляют 1 каплю 10% раствора уксусной кислоты и нагревают до кипения. Осадка не образуется, т.к. в сильнокислой среде частицы белка приобретают положительный заряд (сохраняется один из факторов устойчивости белка в растворе); в 4-ю пробирку наливают 1 каплю раствора NaOH, нагревают до кипения. Осадок не образуется, поскольку в щелочной среде отрицательный заряд белка увеличивается.
Осаждение концентрированными минеральными кислотами.
Концентрированные кислоты (серная, хлористоводородная, азотная и др.) вызывают денатурацию белка за счет удаления факторов устойчивости белка в растворе (заряда и гидратной оболочки). Однако при избытке хлористоводородной и серной кислоты выпавший осадок денатурированного белка снова растворяется. По-видимому, это происходит в результате перезарядки молекул белка и частичного их гидролиза. При добавлении избытка азотной кислоты растворения осадка не происходит. Вот почему для определения малых количеств белка в моче при клинических исследованиях применяется азотная кислота.
1) яичный белок,1% раствор;
2) концентрированная серная кислота;
3) концентрированная хлористоводородная кислота;
4) концентрированная азотная кислота.
Ход определения. В три пробирки наливают по 5 капель концентрированной серной, хлористоводородной и азотной кислот. затем, наклонив пробирку под углом 45 градусов, осторожно по стенке наслаивают такой же объем яичного белка. На границе двух слоев появляется осадок белка в виде белого кольца. Осторожно встряхивают пробирки, наблюдают растворение белка в пробирках с серной и хлористоводородной кислотами, в пробирке с азотной кислотой растворения белка не происходит.
Осаждение органическими кислотами.
Трихлоруксусная кислота осаждает только белки, а сульфосалициловая осаждает не только белки, но и высокомолекулярные пептиды. Сульфосалициловой кислотой пользуются при определении белка в моче.
1) яичный белок, 1% раствор;
2) трихлоруксусная кислота, 10% раствор;
3) сульфосалициловая кислота, 10% раствор.
Ход определения. В две пробирки вносят по 5 капель раствора белка. В одну из них прибавляют 2 капли сульфосалициловой кислоты, а в другую — 5 капель трихлоруксусной кислоты. В пробирках выпадает осадок белка.
Осаждение белка солями тяжелых металлов.
Белки при взаимодействии с солями свинца, меди, ртути, серебра и других тяжелых металлов денатурируются и выпадают в осадок. Однако при избытке некоторых солей наблюдается растворение первоначально образовавшегося осадка. Это связано с накоплением ионов металла на поверхности денатурированного белка и появлением положительного заряда на белковой молекуле.
1) яичный белок, 1% раствор;
2) сульфат меди, 10% раствор;
3) ацетат свинца, 5% раствор;
4) нитрат серебра, 5% раствор.
Ход определения. В три пробирки вносят по 5 капель белка. В первую добавляют 1 каплю ацетата свинца, в третью — 1 каплю нитрата серебра. Во всех пробирках выпадает осадок. Затем в первую пробирку добавляют 10 капель нитрата серебра — растворения осадка нет.
Получение раствора растительного белка и изучение его свойств
Материалы и оборудование:
гороховая мука; пробирки в штативе; фильтры; колбочки; воронки; спиртовка; водяная баня; растворы: концентрированный раствор сернокислого аммония (NH4)2SO4, слабый и концентрированный раствор хлористого натрия NaCl, сухая соль NaCl, концентрированные кислоты HNO3, НСl, H2SO4, Миллонов реактив, аммиак, 5% раствор CuSO4, 1% раствор CuSO4, 10% раствор NaOH, 5% раствор уксуснокислого свинца.
Белки составляют основную часть протоплазмы растительных клеток. Они представляют собой макромолекулы, состоящие из одной или нескольких полипептидных цепей. Каждая полипептидная цепь построена из большого количества аминокислотных остатков, соединенных пептидной ковалентной связью -CO-NH-. Белки подразделяются на простые, состоящие только из аминокислот, и сложные, содержащие кроме белковой части небелковые компоненты. Каждому белку свойственна своя особая геометрическая форма или конформация. Под воздействием физических или химических факторов белковая молекула может утратить присущую ей конформацию. Этот процесс называют денатурацией. При денатурации молекула развертывается и теряет способность выполнять свою обычную биологическую функцию. Иногда денатурированный белок в подходящих условиях вновь спонтанно приобретает свою нативную структуру. Этот процесс называют денатурацией.
Запасные белки можно довольно легко экстрагировать из растительной ткани определенными растворителями. Так, альбумины растворимы в воде, глобулины — в нейтральных солях (10% сульфат или хлорид натрия), проламины — в 70% спирте, глютелины — в слабых щелочах.
Белки, осуществляющие многочисленные химические реакции внутри клетки и являющиеся биологическими катализаторами, называют ферментами.
В колбу насыпать 3-5 г гороховой муки, залить 20-30 мл 10%-го раствора сернокислого аммония (NH4)2SO4, закрыв пробкой или пальцем, трясти в течение 3-5 минут, после чего поставить колбочку на 30 минут отстаиваться. Приготовить складчатый фильтр, профильтровать через него раствор из колбы. Если первые капли фильтрата мутные, слить его обратно на фильтр. В фильтрате будет находиться глобулин, с которым следует проделать ряд характерных реакций.
- Осаждение белков кипячением. В пробирку наливают 1 мл раствора белка и нагревают до кипения. Происходит денатурация белка. Явление денатурации вызывается глубокими нарушениями структуры белка.
- Осаждение белков солями тяжелых металлов. Белки с тяжелыми металлами образуют соли, нерастворимые в воде. К 1 мл раствора белка приливают по каплям 5%-й раствор СuSO4. Появляется осадок, растворяющийся в избытке реактива.
К 1 мл белка приливают по каплям 5%-й раствор уксуснокислого свинца. Появляется осадок, растворяющийся в избытке реактива.
- Осаждение белка кислотами. К 2 мл раствора белка добавить 2-3 капли крепкой кислоты HCl или НNO3, образуется белый осадок.
- Осаждение белков сульфатом аммония.
К 2 мл раствора белка приливают 2 мл насыщенного раствора сульфата аммония и перемешивают. Выпадает осадок глобулинов.
Цветные реакции на белки:
Обусловлена наличием пептидных связей в молекуле белка, благодаря которым в щелочной среде с солями меди белок образует цветную комплексную соль.
К 1 мл раствора белка прилить 1 мл 10%-го раствора NaOH и 1-2 капли 1%-го раствора СuSО4. Наблюдать появление окрашивания.
Основана на способности присутствующих в молекуле белка, ароматических аминокислот: (тирозина, триптофана и фенилаланина) образовывать с концентрированной азотной кислотой при подогревании желтоокрашенные нитросоединения.
К 1 мл раствора белка приливают 3-4 капли концентрированной НNОз. Выпадает осадок, который при подогревании приобретает желтую окраску. Если после охлаждения в пробирку добавить 1 мл концентрированного раствора аммиака, то желтое окрашивание переходит в оранжевое.
Обусловлена наличием в молекуле белка аминокислоты тирозина. К 1 мл раствора белка прилить I мл реактива Миллона. Появляется белый осадок, который при подогревании приобретает розово-красный цвет.
- Реакция с уксуснокислым свинцом.
Положительная реакция указывает на наличие в белковой молекуле цистина и цистеина, содержащих серу.
К 1 мл раствора белка прилить двойной объем 10%—го раствора NаОН, перемешать, кипятить 2-3 мин, затем прибавить 1-2 капли 5%-го раствора уксуснокислого свинца и продолжить нагревание до выпадения черного осадка PbS. Реакция идет по следующим уравнениям:
R — SH + 2NaОH ® Nа2S + R — OH +H2О ,
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 7. Лабораторная работа 7 Обмен белков и нуклеиновых кислот Цель работы изучить важнейшие свойства аминокислот и белков
Название | Лабораторная работа 7 Обмен белков и нуклеиновых кислот Цель работы изучить важнейшие свойства аминокислот и белков |
Анкор | ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 7.doc |
Дата | 05.05.2017 |
Размер | 377 Kb. |
Формат файла | |
Имя файла | ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 7.doc |
Тип | Лабораторная работа #7060 |
страница | 2 из 3 |
Подборка по базе: Курсовая работа Банкротство предприятий понятие, причины, профил, Лабораторная работа Создание командного файла.docx, Контрольная работа по истории.docx, ДИПЛОМНАЯ РАБОТА.docx, Практическая работа №3. Маслов А.С.doc, Лабораторная работа_Европа (3).pdf, Лабораторная работа 1-2.docx, Сам. работа 3.2. История.docx, Практическая работа № 9 РПДА Леднев К.Г..doc, Практическая работа № 6 ГИД УРАЛ Леднев К.Г..doc 1. Нормы потребления белка и структура белкового питания. 2. Что такое незаменимые аминокислоты? 3. Какова роль соляной кислоты желудочного сока в переваривании белков? 4. Под влиянием каких ферментов пищеварительного тракта и через какие промежуточные продукты протекает последовательный распад белков до аминокислот? 5. Участие аминокислот в пластическом обмене (синтез белков, реакции переаминирования и декарбоксилирования). 6. Участие белков в энергетическом обмене (мобилизация, реакция окислительного дезаминирования аминокислот). 7. Конечный продукт обмена белков (где образуется, как устраняется из организма?). Лабораторная работа № 7 Свойства белков Существует два типа цветных реакций: 1) универсальные – биуретовая (на все белки) и нингидриновая (на все а-аминокислоты и белки); При проведении цветных реакций на белки и аминокислоты необходимо предварительно составить следующую таблицу:
В пробирку наливают 1 мл. неразбавленного куриного белка добавляют 2 мл. концентрированного раствора щелочи, кладут несколько кипятильников. К горячему раствору добавляют раствор плюмбита натрия – образуется желто-бурое или черное окрашивание. (Плюмбит натрия готовят следующим образом: к 1 мл уксуснокислого свинца добавляют раствор щелочи по каплям до растворения образующего вначале осадка гидроксида свинца). При наличии в молекуле белка серосодержащих аминокислот (цистина, цистеина) из этих аминокислот постепенно отщепляется сера в виде иона в степени окисления – 2, наличие которого и обнаруживается ионом свинца, образующим с ионом серы черный нерастворимый сульфид свинца: Pb(CH3COO)2 + 2NaOH Pb(OH)2 + 2 CH3COONa, Na2S + Na2PbO2 + 2H2O PbS + 4NaOH. Оформление опыта: сделать вывод и написать уравнение реакции. Рассмотрим механизм ксантопротеиновой реакции по радикалу тирозина: Рассмотрим механизм ксантопротеиновой реакции по радикалу тирозина:
Оформление опыта: сделать вывод и написать уравнение реакции. Эту же реакцию на триптофан можно провести, используя вместо уксусной кислоты формальдегид 2,5%-ный раствор концентрированной H2SO4. Раствор перемешать и через 2-3 мин. добавить при взбалтывании 10 капель 5%-ного нитрита натрия. Развивается интенсивно-фиолетовое окрашивание, на этом основан принцип метода реакции. Через 5-10 минут на границе раздела двух слоев наблюдают образование красно-фиолетового кольца.
Реакция с нингидрином используется для визуального обнаружения a-аминокислот на хроматограммах (на бумаге, в тонком слое), а также для колориметрического определения концентрации аминокислот по интенсивности окраски продукта реакции. Продукт этой реакции содержит в своем составе радикал (R) исходной аминокислоты, который обусловливает различную окраску: голубую, красную, и т.д. соединений, возникающих при реакции аминокислот с нингидрином. В настоящее время нингидриновая реакция широко используется как для открытия отдельных аминокислот, так и для определения их количества. Опыт 6. Реакция Сакагучи. Принцип метода. Эта реакция на аминокислоту аргинин основана на взаимодействии аргинина с a-нафтолом в присутствии окислителя. Ее механизм еще полностью не выяснен. По-видимому, реакция осуществляется по следующему уравнению: Поскольку производные хинониминов (в данном случае нафтохинона), у которых водород иминогруппы –NH– замещен на алкильный или арильный радикал, всегда окрашены в желто-красные тона, то, по-видимому, оранжево-красный цвет раствора при проведении реакции Сакагучи объясняется возникновением именно производного нафтохинонимина. Не исключена, однако, вероятность образования еще более сложного соединения за счет дальнейшего окисления оставшихся NH-групп аргининового остатка и бензольного ядра a-нафтола: Немедленно добавляют 1 мл 40%-го раствора мочевины для стабилизации, быстро развивающегося оранжево-красного окрашивания. NH = C –NH2, и указывает на присутствие в белковой молекуле аминокислоты-аргинина: Известно, что белки в растворе сохраняются в природном состоянии за счёт факторов устойчивости, к которым относятся заряд белковой молекулы и гидратная (водная) оболочка вокруг нее. Удаление этих факторов приводит к склеиванию этих молекул белка и выпадению в осадок. Осаждение белков может быть обратимым и необратимым в зависимости от природы используемых реактивов. Обратимое осаждение – при этом процессе под воздействием факторов осаждения белки выпадают в осадок, но после прекращения действия этих факторов белки вновь переходят в растворимое состояние и приобретают свои нативные свойства. Одним из видов обратимого осаждения белков является высаливание. Необратимое осаждение белков связано с глубокими нарушениями структуры белков (вторичной и третичной) и потерей ими нативных свойств. Такие изменения белков можно вызвать кипячением, действием концентрированных растворов минеральных и органических кислот, солями тяжелых металлов. Для высаливания белков используют соли щелочных и щелочноземельных металлов (наиболее часто в практике используют сульфат натрия и аммония). Эти соли удаляют водную оболочку (вызывают обезвоживание) и снимают заряд. Между величиной водной оболочки белковых молекул и концентрацией солей существует прямая зависимость: чем меньше гидратная оболочка, тем меньше требуется солей. Так, глобулины, имеющие крупные и тяжелые молекулы и небольшую водную оболочку, выпадают в осадок при неполном насыщении раствора солями, а альбумины как более мелкие молекулы, окруженные большой водной оболочкой, – при полном насыщении. Денатурация белка (необратимое осаждение) сводится к разрушению третичной и частично вторичной структуры белковой молекулы врезультате разрыва водородных связей и потере им биологических или нативных свойств. При необратимых реакциях осаждения белки претерпевают глубокие изменения и не могут быть растворимы в первоначальном растворителе. К необратимым реакциям относятся осаждение белка солями тяжелых металлов, минеральными и органическими кислотами, алкалоидными реактивами и осаждение при кипячении. Насыщенным раствором сульфата аммония осаждается альбуминовая фракция белков, полунасыщенным раствором – глобулиновая фракция. Сущность реакции заключается в дегидратации молекул белка. Порядок выполнения работы. Получают полунасыщенный раствор сульфата аммония и также смешивают (1:1) с яичным белком, при этом глобулиновая фракция осаждается, а альбуминовая остается в растворе. Последнюю отфильтровывают, затем смешивают с порошком сульфата аммония до тех пор, пока не прекратится растворение соли, при этом выпадает осадок – альбумины. К образовавшимся осадкам (глобулинов и альбуминов) добавляют воду и наблюдают их растворение. Это доказывает, что высаливание – процесс обратимый. источники: http://dimkao.ru/poluchenie-rastvora-rastitelnogo-belka-i-izuchenie-ego-svojstv/ http://topuch.ru/laboratornaya-rabota-7-obmen-belkov-i-nukleinovih-kislot-cele/index2.html |