Раствор белка сульфат аммония уравнение реакции

1. Нормы потребления белка и структура белкового питания.

2. Что такое незаменимые аминокислоты?

3. Какова роль соляной кислоты желудочного сока в переваривании белков?

4. Под влиянием каких ферментов пищеварительного тракта и через какие промежуточные продукты протекает последовательный распад белков до аминокислот?

5. Участие аминокислот в пластическом обмене (синтез белков, реакции переаминирования и декарбоксилирования).

6. Участие белков в энергетическом обмене (мобилизация, реакция окислительного дезаминирования аминокислот).

7. Конечный продукт обмена белков (где образуется, как устраняется из организма?).

Лабораторная работа № 7

Свойства белков
Цветные реакции на белки и аминокислоты.
Значение цветных реакций состоит в том, что они дают возможность обнаружить присутствие белка в биологических жидкостях, растворах и установить аминокислотный состав различных природных белков. Эти реакции применяются как для качественного, так и для количественного определения белка и содержащихся в нем аминокислот. Некоторые реакции присущи не только белкам, но и другим веществам, например, фенол, подобно тирозину, дает розово-красное окрашивание с реактивом Миллона, поэтому проведения одной какой-либо реакции для установления наличия белка не достаточно.

Существует два типа цветных реакций: 1) универсальные – биуретовая (на все белки) и нингидриновая (на все а-аминокислоты и белки);
2) специфические – только на определенные аминокислоты как в молекуле белка, так и в растворах отдельных аминокислот, например реакция Фоля (на аминокислоты, содержащие слабосвязанную серу), реакция Миллона (на тирозин), реакция Сакагучи (на аргинин) и др.

При проведении цветных реакций на белки и аминокислоты необходимо предварительно составить следующую таблицу:
Цветные реакции на белки (качественные реакции)

Цветные реакции на белки

Опыт 1. Биуретовая реакция.
Биуретовая реакция – качественная на все без исключения белки, а также продукты их неполного гидролиза, которые содержат не менее двух пептидных связей.

Принцип метода. Биуретовая реакция обусловлена присутствием в белках пептидных связей (- СО – NH -), которые в щелочной среде образуют с сульфатом меди (ІІ) окрашенные в красно-фиолетовый цвет медные солеобразные комплексы. Биуретовую реакцию дают также некоторые небелковые вещества, например биурет (NH₂-CO-NH-CO-NH₂), оксамид (NH₂CO-CO-NH₂), ряд аминокислот (гистидин, серин, треонин, аспарагин).

Биуретовая реакция с глицином

Порядок выполнения работы.
К 1 мл исследуемого 1% раствора белка добавляют равный объем 10 % раствора гидроксида натрия (NaOH) щелочи и затем 2-3 капли 1 % раствора сульфата меди (CuSO₄). разбавленного, почти бесцветного раствора медного купороса.

При положительной реакции появляется фиолетовая окраска с красным либо синим оттенком.
Вывод:

Опыт 2. Реакция на «слабосвязанную серу».
Принцип метода. Это реакция на цистеин и цистин. При щелочном гидролизе «слабосвязанная сера» в цистеине и цистине достаточно легко отщепляется, в результате чего образуется сероводород, который, реагируя со щелочью, дает сульфиды натрия или калия. При добавлении ацетата свинца(II) образуется осадок сульфида свинца(II) серо-черного цвета.
Порядок выполнения работы.
В пробирку наливают 1 мл неразбавленного куриного белка, прибавляют 2 мл 20%-го раствора гидроксида натрия. Смесь осторожно кипятят (чтобы смесь не выбросило).

При этом выделяется аммиак, который обнаруживается по посинению влажной лакмусовой бумажки, поднесенной к отверстию пробирки (не касаться стенки). Образующийся незначительный осадок растворяется при кипении, а затем добавляют 0,5 мл раствора ацетата свинца(II). Наблюдается выпадение серо-черного осадка сульфида свинца(II):

В пробирку наливают 1 мл. неразбавленного куриного белка добавляют 2 мл. концентрированного раствора щелочи, кладут несколько кипятильников. К горячему раствору добавляют раствор плюмбита натрия – образуется желто-бурое или черное окрашивание. (Плюмбит натрия готовят следующим образом: к 1 мл уксуснокислого свинца добавляют раствор щелочи по каплям до растворения образующего вначале осадка гидроксида свинца).

При наличии в молекуле белка серосодержащих аминокислот (цистина, цистеина) из этих аминокислот постепенно отщепляется сера в виде иона в степени окисления – 2, наличие которого и обнаруживается ионом свинца, образующим с ионом серы черный нерастворимый сульфид свинца:

Pb(CH₃COO)₂ + 2NaOH Pb(OH)₂ + 2 CH₃COONa,
Pb(OH)₂ + 2NaOH Na₂PbO₂ + H₂O,

Na₂S + Na₂PbO₂ + 2H₂O PbS + 4NaOH.

Оформление опыта: сделать вывод и написать уравнение реакции.
Опыт 3. Ксантопротеиновая реакция белков.
Принцип метода. Эта реакция используется для обнаружения a-аминокислот, содержащих ароматические радикалы. Тирозин, триптофан, фенилаланин при взаимодействии с концентрированной азотной кислотой образуют нитропроизводные, имеющие желтую окраску. В щелочной среде нитропроизводные этих a-аминокислот дают соли, окрашенные в оранжевый цвет. Желатин, например, не содержащий ароматических аминокислот, не дает ксантопротеиновой пробы.
Порядок выполнения работы.
К 1 мл 10 %-го раствора белка куриного яйца добавляют 0,5 мл концентрированной азотной кислоты. В результате коагуляции белка в содержимом пробирки образуется белый осадок или помутнение. При нагревании раствор и осадок окрашиваются в ярко-желтый цвет. При этом осадок почти полностью растворяется в результате гидролиза. После охлаждения добавляют 1–2 мл 20%-го раствора гидроксида натрия (до появления оранжевой окраски раствора).

Рассмотрим механизм ксантопротеиновой реакции по радикалу тирозина:

Рассмотрим механизм ксантопротеиновой реакции по радикалу тирозина:

Оформление опыта: сделать вывод и написать уравнение реакции.
Опыт 4. Реакция Адамкевича (на присутствие в белках триптофана).
Принцип метода. Белки, содержащие триптофан, в присутствии глиоксиловой и серной кислот дают красно-фиолетовое окрашивание. Реакция основана на способности триптофана взаимодействовать в кислой среде с альдегидами глиоксиловой кислоты (являющейся примесью к концентрированной уксусной кислоте) с образованием окрашенных продуктов конденсации. Реакция протекает по уравнению:

Желатин не дает этой реакции, т.к. он не содержит триптофана. Окраска возникает за счет реакции триптофана с глиоксиловой кислотой, всегда присутствующей в уксусной кислоте в виде примеси.

Эту же реакцию на триптофан можно провести, используя вместо уксусной кислоты формальдегид 2,5%-ный раствор концентрированной H₂SO_4. Раствор перемешать и через 2-3 мин. добавить при взбалтывании 10 капель 5%-ного нитрита натрия. Развивается интенсивно-фиолетовое окрашивание, на этом основан принцип метода реакции.
Порядок выполнения работы.
В пробирку наливают несколько капель неразбавленного белка и прибавляют 2 мл. ледяной уксусной кислоты и несколько капель глиоксиловой кислоты. Смесь слегка нагревают до растворения образующегося осадка, охлаждают и, сильно наклонив пробирку, осторожно по стенке приливают концентрированную H₂SO₄ так, чтобы обе жидкости не смешивались.

Через 5-10 минут на границе раздела двух слоев наблюдают образование красно-фиолетового кольца.
Оформление опыта: сделать вывод и написать уравнение реакции.
Опыт 5. Нингидриновая реакция.
Принцип метода. a-Аминокислоты реагируют с нингидрином, образуя сине-фиолетовый комплекс (пурпур Руэманна), интенсивность окраски которого пропорциональна количеству аминокислоты. Реакция идет по схеме:

Реакция с нингидрином используется для визуального обнаружения a-аминокислот на хроматограммах (на бумаге, в тонком слое), а также для колориметрического определения концентрации аминокислот по интенсивности окраски продукта реакции.

Продукт этой реакции содержит в своем составе радикал (R) исходной аминокислоты, который обусловливает различную окраску: голубую, красную, и т.д. соединений, возникающих при реакции аминокислот с нингидрином.

В настоящее время нингидриновая реакция широко используется как для открытия отдельных аминокислот, так и для определения их количества.
Порядок выполнения работы.
В пробирку наливают 1 мл 1-10%-го разбавленного раствора белка куриного яйца и 1-2 мл 1%-го раствора нингидрина в ацетоне. Содержимое пробирки перемешивают и в течение 2-3 мин осторожно нагревают на водяной бане до появления сине-фиолетового окрашивания, свидетельствующее о присутствии в белке α-аминокислот.
Оформление опыта: сделать вывод и написать уравнение реакции.

Опыт 6. Реакция Сакагучи.

Принцип метода. Эта реакция на аминокислоту аргинин основана на взаимодействии аргинина с a-нафтолом в присутствии окислителя. Ее механизм еще полностью не выяснен. По-видимому, реакция осуществляется по следующему уравнению:

Поскольку производные хинониминов (в данном случае нафтохинона), у которых водород иминогруппы –NH– замещен на алкильный или арильный радикал, всегда окрашены в желто-красные тона, то, по-видимому, оранжево-красный цвет раствора при проведении реакции Сакагучи объясняется возникновением именно производного нафтохинонимина. Не исключена, однако, вероятность образования еще более сложного соединения за счет дальнейшего окисления оставшихся NH-групп аргининового остатка и бензольного ядра a-нафтола:
Порядок выполнения работы.
К 2 мл. 1%-го разбавленного раствора белка куриного яйца добавляют 2 мл. 10%-го гидроксида натрия (NaOH) и несколько капель 0,2%-ного спиртового раствора α-нафтола. Содержимое пробирки хорошо перемешивают. Затем приливают 0,5 мл. гипобромита натрия (NaBrO) или гипохлорита натрия (натрий хлорноватистокислый – NaOCl), перемешивают. Тотчас появляется красное, постепенно усиливающееся окрашивание.

Немедленно добавляют 1 мл 40%-го раствора мочевины для стабилизации, быстро развивающегося оранжево-красного окрашивания.
Эта реакция характерна для соединений, содержащих остаток гуанидина

NH = C –NH₂,
NH₂

и указывает на присутствие в белковой молекуле аминокислоты-аргинина:
NH = C –NH – (CH₂)₃ –CH –COOH
NH₂ NH₂
Оформление опыта: сделать вывод и написать уравнение реакции.
Реакции осаждения белков

Известно, что белки в растворе сохраняются в природном состоянии за счёт факторов устойчивости, к которым относятся заряд белковой молекулы и гидратная (водная) оболочка вокруг нее. Удаление этих факторов приводит к склеиванию этих молекул белка и выпадению в осадок. Осаждение белков может быть обратимым и необратимым в зависимости от природы используемых реактивов.

Обратимое осаждение – при этом процессе под воздействием факторов осаждения белки выпадают в осадок, но после прекращения действия этих факторов белки вновь переходят в растворимое состояние и приобретают свои нативные свойства. Одним из видов обратимого осаждения белков является высаливание.

Необратимое осаждение белков связано с глубокими нарушениями структуры белков (вторичной и третичной) и потерей ими нативных свойств. Такие изменения белков можно вызвать кипячением, действием концентрированных растворов минеральных и органических кислот, солями тяжелых металлов.

Для высаливания белков используют соли щелочных и щелочноземельных металлов (наиболее часто в практике используют сульфат натрия и аммония). Эти соли удаляют водную оболочку (вызывают обезвоживание) и снимают заряд. Между величиной водной оболочки белковых молекул и концентрацией солей существует прямая зависимость: чем меньше гидратная оболочка, тем меньше требуется солей. Так, глобулины, имеющие крупные и тяжелые молекулы и небольшую водную оболочку, выпадают в осадок при неполном насыщении раствора солями, а альбумины как более мелкие молекулы, окруженные большой водной оболочкой, – при полном насыщении.

Денатурация белка (необратимое осаждение) сводится к разрушению третичной и частично вторичной структуры белковой молекулы врезультате разрыва водородных связей и потере им биологических или нативных свойств. При необратимых реакциях осаждения белки претерпевают глубокие изменения и не могут быть растворимы в первоначальном растворителе. К необратимым реакциям относятся осаждение белка солями тяжелых металлов, минеральными и органическими кислотами, алкалоидными реактивами и осаждение при кипячении.
Опыт 1. Высаливание белков сульфатом аммония.
Принцип метода. Высаливание – это добавление к раствору белка нейтральных солей (Na₂SO₄, (NH₄)₂SO₄). Механизм высаливания заключается во взаимодействии анионов (SO₄ 2– ) и катионов (Na + , NH₄ + ) с зарядами белка (группы NH₄ + и COO – ). В результате заряд исчезает, и соответственно, исчезает взаимоотталкивание молекул. Одновременно резко уменьшается гидратная оболочка. Все это приводит к «слипанию» молекул и осаждению.

Насыщенным раствором сульфата аммония осаждается альбуминовая фракция белков, полунасыщенным раствором – глобулиновая фракция.

Сущность реакции заключается в дегидратации молекул белка.

Порядок выполнения работы.
В пробирку наливают 30 капель неразведённого яичного белка и добавляют равное количество насыщенного раствора сульфата аммония. Содержимое пробирки перемешивают. При этом осаждается альбуминовая фракция белков.

Получают полунасыщенный раствор сульфата аммония и также смешивают (1:1) с яичным белком, при этом глобулиновая фракция осаждается, а альбуминовая остается в растворе. Последнюю отфильтровывают, затем смешивают с порошком сульфата аммония до тех пор, пока не прекратится растворение соли, при этом выпадает осадок – альбумины.

К образовавшимся осадкам (глобулинов и альбуминов) добавляют воду и наблюдают их растворение. Это доказывает, что высаливание – процесс обратимый.
Оформление опыта: полученные результаты опыта записать в тетрадь и сделать вывод.

Раствор белка сульфат аммония уравнение реакции

Обычно, когда говорят о высаливании, имеют в виду высаливание именно сульфатом аммония. Этому методу уже более 130 лет. Раньше он применялся и для фракционирования, сейчас, в основном, как дешёвый и удобный метод осаждения белков. Можно считать, что повезло, если при этом получается ещё и существенная очистка (при высаливании из клеточного экстракта можно расчитывать на приблизительно 2-10 кратное обогащение).

Смотри также:
/ссылки на сетевые ресурсы/

Дополнения, комментарии, вопросы

Растворимость сульфата аммония в воде при 20 С около 5.7М, причем при 0 градусов снижается примерно на 0,5М, не верите, возьмите справочник, или проверьте сами.

В разделе осаждение белков сульфатом аммония в примере с рассчётом ионной силы(второй случай), по-моему необходимо читать:I=1/2*(2*(1)^2+1*(2)^2), поскольку заряд сульфат иона, записанный в скобках во втором слагаемом, равен 2. Тогда и ответ получается верным

Изучал высаливание билихромопротеидов (фикоцианина и фикоэритрина) синезелёных водорослей в 1974 году. Белки ярко окрашены и за их поведением очень удобно наблюдать. При этих наблюдениях выяснилось, что «в действительности всё совсем не так, как на самом деле». Для полного перехода белков из раствора в осадок достаточно изменить насыщенность раствора сульфата аммония всего на 0,1. 0,2%. Но осадок вблизи этой концентрации (точки осаждения) очень неустойчив. Растворяется даже от вибрации центрифуги. Поэтому для его отделения от раствора можно использовать только фильтрование, причём с очень низкими скоростями (1. 2 мл/см2 в минуту). Сам знаю, что это противоречит всем канонам, но это было подтверждено не только фильтрованием, но и измерением оптической плотности растворов при различных концентрациях соли. При длительном стоянии растворов с повышающимися концентрациями сульфата аммония без вибрации и перемешивания оптическая плотность окрашенных белков на графике растворимости падает почти отвесно.

Для осаждения иммуноглобулинов из желтка яиц, я использовал аммония сульфат в конечной концентрации 50%, однако центифугированием никак не удалось осадит преципитат.Во всех случаях получался пленка состаяшаяся из липопротеидов и иммуноглобулинов.

Новейшие данные о рядах Гофмейстера читайте в статье:
Lo Nostro P, Ninham BW, Milani S, Lo Nostro A, Pesavento G, Baglioni P.
Hofmeister effects in supramolecular and biological systems.
Biophys Chem. 2006 Apr 26; (корректура)

скажите пожалуйста как влияет размер белка на эффективность его высаливания сернокислым аммонием,
есть ли какая либо зависимость типа чем меньше белок тем хуже высаливается?

Для эффективности высаливания важнее конечная концентрация белка в растворе и соотношение гидрофильных и гидрофобных аминокислотных остатков на поверхности глобулы. Конечно, белки меньше 5-10 кДа высаливать труднее, потому что мелкие гидрофобные частицы слипаются и осаждаются хуже. Правда тут есть ухищрения: можно добавить несколько баластных белков (выпадающих при разных насыщающих концентрациях и, от которых потом легко избавиться) с ними легче соосаждаются маленькие белки в низкой концентрации.

2 Maya: A eshe mojno precipitirovat «bolshie» belki,esli takovie prisutstvujut v smesi,s pomoshju poliethylenglykolja 6000.Interesujushaja Vas «meloch» budet v supernatante plavat.Vy ego prosto skoncentrirujte potom v slide-A-lysere polojiv etu kameru s rastvorom na Sephadex ili PEG

Зависимость о размера есть, но не прямая. Лучше высаливаются кислые белки. Желательно работать при высокой концентрации белков. При низкой образование осадка идёт медленнее. По этой причине обычно рекомендуется использовать высаливание на самой первой стадии — для грубых экстрактов, содержащих большое количество примесей. При этом идёт сильное соосаждение, т.е. целевой белок захватывается осадком даже помимо своего «желания». Оптимальный вариант — это экстракционное высаливание, т.е. сначала осаждаете белок со всеми примесями, а потом растворяете осадок в дистиллированной воде и добавляете насыщенный раствор сульфата аммония в требуемой пропорции. Осадок растворяете и высаливаете повторно, но соотношение воды и соли понижаете, и т.д. Ко всем полученным супернатантам добавляете насыщенный раствор соли, центрифугируете и получаете серию осадков, в которых ищете свой белок. Если точка высаливания известна, то сразу ориентируетесь на требуемое соотношение воды и насыщенного раствора соли. Ступенчатую экстракцию можно проводить повторно и с различными интервалами процента насыщения раствора соли. Для крупных белков можно добиться осаждения в интервале 1. 2% насыщения, причём без существенных потерь. Для мелких интервал требуется немного шире (3. 5%).

Главное — дистиллированную воду брать только свежекипячёную. Иначе белки погибнут от «кессонной болезни».

наверное, в общем и целом, маленькие белки будут высаливаться хуже. но и зависимость от других их свойств и от присутствия в растворе других белков тоже будет немалой.

помимо вышеуказанных способов, эффективность высаливания можно повысить еще
1. изменением рH. вблизи pI растворимость белка уменьшается.
2. увеличением температуры. например, до комнатной. с увеличением температуры гидрофобные взаимодействия, на которых преимущественно высаливание и зиждется, услиливаются. но это подойдет если интересующий белок достаточно термостабилен и не сильно подвержен протеолизу.

боюсь, с pH не шибко получится, потому что:
1) сернокислый аммоний сам изменяет рН — закисялет, так что вопрос — хватит ли буферной емкости
2) если и хватит — тот же самый сернокислый аммоний создает немалую ионную силу, так что кулоновские взаимодействия, на которых в основном основывается изоэлектрическое осаждение, будут невелироваться, думается

с температурой согласен

1. рН можно довести после добавления СА
2. правда ваша. но, думается, уменьшение электростатического отталкивания при приближении к pI будет способствовать лучшему «слипанию» и за счет гидрофобных взаимодействий.
как бы то ни было, но это работает. например, один из методов очистки ГАФД на этом основан.

2 Maya: A vy sluchem ne FEN NGU zakanchivali?

При осаждени белка персульфатом аммония насколько важно чтоб центрифугирование проводилось с охлаждением? и достаточно ли 10000 т.о. (на цф типа эппендорф) минут пяти?

Вы слегка перепутали. Персульфат аммония — реактив, который используется обычно для инициации полимеризации акриламидного геля. Белки фракционируют сульфатом аммония. Для осаждения (переосаждения) белков сульфатом не обязательно охлаждать все в процессе ц/ф. Вполне можно обойтись настольной высокооборотной центрифугой (эппендорф очень даже подходит). Условия ц/ф (время и обороты) зависят от конечной концентрации сульфата аммония в растворе.
Если конечная концентрация сульфата не превышает 0,8 насыщения (это около 3,2М или 0,55 г/мл) то можно крутить 10-12 тыс. об/мин, 3-4 мин. Только перед ц/ф предварительно охладите пробирки в холодильнике (лучше в морозилке, но не переусердствуйте, чтобы не замерзло все).

спасибо!
да что-то у меня замкнуло приписать ПЕР к сульфату.

Кстати, иногда при высоких концентрациях сульфата белки не тонут, а всплывают.

Табличка насыщения сульфата дана при 0С, при комнате растворимость сульфата выше и следовательно процент насыщения при той же концентрации ниже. Но все это фигня, потаму чта сульфат есть грубый реагент и никакие тонкости не повысят точность фракционирования.

Кстати, иногда при высоких концентрациях сульфата белки не тонут, а всплывают.

. все это фигня, потаму чта сульфат есть грубый реагент и никакие тонкости не повысят точность фракционирования.

Белки могут всплывать как при высоких, так и при низких концентрациях сульфата аммония. При растворении соли выделяются микропузырьки воздуха, которые придают осадкам белка положительную плавучесть. Для борьбы с этим желательно:
1. Растворять исходный препарат белка в свежекипячёной воде (буфере).
2. Добавлять не соль, а её насыщенный раствор.
3. Если осадок всё-таки всплыл, то его можно не отцентрифугировать, а отфильтровать.

Сульфат — очень тонкий реагент, позволяющий фракционировать даже близкие по свойствам белки. Мне удавалось при помощи высаливания разделить фикоцианин и фикоэритрин синезелёной водоросли, отличающиеся только хромофорной группой. Высаливание при этом проводилось изменением насыщения соли на 0,1%.

Есть множество тонкостей, позволяющих повысить точность фракционирования при высаливании белков.

—Сульфат — очень тонкий реагент, позволяющий фракционировать даже близкие по свойствам белки. Мне удавалось при помощи высаливания разделить фикоцианин и фикоэритрин синезелёной водоросли, отличающиеся только хромофорной группой. Высаливание при этом проводилось изменением насыщения соли на 0,1%.

НЕ ВЕрю. Особенно, если в смеси была хотябы еще парочка десятков других белков в значимой концентрации. Хотя с конкретно этими белками я не знаком возможно это и так, но это скорее исключение чем правило.

Есть множество тонкостей, позволяющих повысить точность фракционирования при высаливании белков.

А клоны антител не пробовали делить из поликлональных сывороток.

Белки могут всплывать как при высоких, так и при низких концентрациях сульфата аммония.

Ага! А плотность раствора соли тут ни при чем.

—Сульфат — очень тонкий реагент, позволяющий фракционировать даже близкие по свойствам белки. Мне удавалось при помощи высаливания разделить фикоцианин и фикоэритрин синезелёной водоросли, отличающиеся только хромофорной группой. Высаливание при этом проводилось изменением насыщения соли на 0,1%.

НЕ ВЕрю. Особенно, если в смеси была хотябы еще парочка десятков других белков в значимой концентрации. Хотя с конкретно этими белками я не знаком возможно это и так, но это скорее исключение чем правило.

Высаливание проводилось из грубого лизата синезелёных водорослей, содержащего десятки основных и тысячи дополнительных белковых примесей.

С тех пор я не верю учебникам, описывающим красивую теорию высаливания белков.

Спустя пару десятков лет развлекался с выделением пероксидазы хрена. У неё точка высаливания где-то на 68 % насыщения. Точнее не определял, но основную часть примесей удавалось убрать высаливанием в интервале 5% насыщения.

Вообще-то воможность проводить тонкое фрационирование белков, меняя концентрацию сульфата аммония на 0,1% вызывает ОЧЕНЬ большие сомнения. Сульфат-аммонийное фракционирование прекрасный метод, он особенно хорош для фракционирования лизатов-гомогенатов, сывороток и т.д., легко маштабируется, хорошо воспроизводится, но не надо делать из него какую-то «сверхметодику сверхочистки». Что касается флотации белка после высаливания, то «всплывание» белка определяется и концентрацией сульфата аммония и природой белка.
Например, при фрационировании гомогената печени 0,7 насыщения сульфата, белок всплывает, а У.З.-лизат E.coli — осаждается. Это еще зависит и от скорости высаливания — genseq абсолютно прав насчет микропузырьков воздуха. Вот только фильтровать сульфатаммонийный осадок — задача непростая и неблагодарная. Лучше открутить (если есть на чем), т.к. при 20000g в 0,8 насыщения сульфате на стенки пробирки садится любой осадок. Если вам пришлось высаживать белок сульфатом до полного насыщения, то тогда или фильтровать или крутить на ультраценрифуге при 80000-100000g.

—С тех пор я не верю учебникам, описывающим красивую теорию высаливания белков.

По учебникам как раз получается, что возможно все.
Это были Вы, Ильич?

—Например, при фрационировании гомогената печени 0,7 насыщения сульфата,

Та, язный пень, чем больше липидов связано с белками, тем легче оне взплывають, как на парашюте.

Не сомневайтесь. Интервал 1. 2% вполне работоспособен. С интервалом 0,1% будут заморочки, но и это вполне реально. Нужно только использовать не повышение концентрации, а экстракционное высаливание с понижающейся концентрацией. Могу поделиться секретами и тонкостями этого метода, но боюсь, что это уже никому не нужно . Народ давно уверовал в гель-хроматографию, иоообменники, HPLC и прочие навороты. Бороться со сторонниками общепринятых подходов — занятие крайне неблагодарное .

—С тех пор я не верю учебникам, описывающим красивую теорию высаливания белков.

По учебникам как раз получается, что возможно все.
Это были Вы, Ильич?

Это был Витальич.

Уважаемый genseg, не поделитесь ли секретами? Мне иногда приходится работать в «полевых условиях» при отсутствии прочих возможностей. Использую обычно высаливание сульфатом, процедура отработана уже. Но если есть тонкости процесса, буду очень благаодарна за помощь. Спасибо.

Основные принципы довольно просты, но мне уже неоднократно доставалось от местных всезнаек. По этой причине лучше обсуждать вопросы высаливания в приватной переписке. Если интерес серьёзен, то жмите на рисунок письма над этим сообщением и пишите на E-mail.

Уважаемый genseq. Экстракционное высаливание действительно очень хорошая модификация сульфат-аамонийного фракционирования. Не требует ни какого специального оборудования или реактивов, дает неплохой выигрыш в очистке при существенном снижении потерь целевого белка на соосаждении с другими. На мой взгляд, эти плюсы с лихвой компенсируют незначительное удлинение всей процедуры. Правда, этот вариант требует гораздо большей тщательности и аккуратности в работе — просто более высокой биохимической культуры.
Но вот на счет работоспособности фракционирования с интервалом 1% и даже с еще меньшим интервалом. Вам крупно повезло, что ваш конкретный белок, который вы выделяете из вашего источника можно фракционировать сульфатом со ступелькой 1% насыщения. Только на сколько целесообразно расширять такое везение, когда вы не знаете о каком белке, из какого источника и для каких целей (т.е. какая нужна чистота) его будет выделять гость? Есть три достаточно серьезных довода, из-за которых фракционирование сульфатом аммония с шагом менее 5% насыщения используется крайне редко независимо от модификации метода (прямое высаливание или экстракция):
1. Многие белки вообще не имеют четкой «точки высаливания» в силу своей природы. Наиболее известный пример (но, увы, далеко не единственный) — это нуклеозиддифосфаткиназа (NDPK). Этот фермент высаливается в интервале от 0,5 до 0,95 насыщения сульфата и все попытки сузить интервал концентраций сульфата или поменять высаливание на экстракцию только приводят к потерям целевого фермента.
2. Подобрать точную концентрацию сульфата, оптимальную для высаливания какого-либо белка, задача достаточно кропотливая. Как ни крути, но для любого варианта надо уметь определять содержание вашего целевого белка в некоторой фракции в присутствии высокой концентрации сульфата аммония. А если ваш белок — это фермент, активность которого подавляется сульфатом? Хорошо, если вы располагаете возможностью детектировать содержание вашего целевого белка напрямую по какой-нибудь экзотической флюорисценции или что-то в этом роде. А как насчет пробоподготовки для белкового э/ф из концетрированного раствора сульфата? Хлопотное и муторное это занятие, а мы , увы, все достаточно ленивы.
3. Всякий метод фракционирования (в том числе и белков) количественно оценивается по степени очистки. Во сколько раз вы очищаете ваш белок на конкретной стадии. Обычно очистка целевого белка до гомогенного состояния по э/ф требуется не часто и для многих задач вполне достаточно очистки по белку в 100-500 раз от исходного гомогената. Если ваш источник — не суперпродуцент вашего продукта, то такая очистка не очень высокая, но во многих случаях вполне приемлема. Сульфат-аммонийное фракционирование, даже самое тонкое, редко дает очистку по белку больше, чем в 4-5 раз. Мне всего однажды крупно повезло и искомый антиген чистился сульфатом аж в 11 раз, но это редкая удача и никакой моей заслуги в том не было — уж очень специфические условия высаливания оказались. Вся остальная очистка «добивалась» хроматографией.
Вообще, позволю себе «крамольную мысль» — сульфат аммония «лучше помогает» не при фракционировании белков. Вам приходилось выделять белки (или ферменты) не из сыворотки крови или культуральной жидкости, а из гомогената ткани? Представляете себе гомогенат печени крысы или минтая, гомогенат человеческой плаценты или икры морского ежа до оплодотворения или гомогенат эмбрионов морского ежа на средней бластуле? Сколько там всего «биологического материала» в растворе, кроме белка? Это не кристаллических змеинный яд и даже на гомогенат E.coli. Цвет и запах весьма специфические и как-то про хроматографию забываешь на прочь. А тут сульфат аммония — богом созданный реагент. Одно-два высаливания — и у вас «благородный белковый раствор». Очистка по белку 3-4 раза — это ерунда, но вы избавились от липидов, полисахаридов, каких-то пигметов, массы низкомолекулярной «шелухи» и даже частично от нуклеиновых кислот. После этого и на колонку не грех, и на э/ф пожалуйста.
Сульфат-аммонийное фракционирование — очень достойный и крайне полезный метод, но совсем не «волшебная палочка». Впрочем, думаю, что если вы поделителсь с менее опытными коллегами своим опытом, это будет просто замечательно за что вам заранее спасибо.

++11

Огромное спасибо форме жизни. Постараюсь соответствовать заданному им уровню дискуссии и поделиться своим небольшим опытом в деле высаливания белков, тем более, что письма от NBSC я так и не получил .

В стародавние времена довелось мне делать дипломную работу в Ин-те биологии внутренних вод и водоёмов. Тамошние биологи пожелали сделать «что-нибудь биохимическое» и для этой цели выписали студента-биохимика (т.е. меня). Единственным объектом, с которым можно было успеть сделать хоть что-нибудь путное, оказались синезелёные водоросли, а единственным удобоваримым прибором — спектрофотометр СФ-4. Поневоле пришлось заняться ярко окрашенными белками — билихромопротеидами. Центрифуги там тоже не было (не говоря уж об ионообменниках) и кроме высаливания, причём с фильтрованием осадков, воспользоваться было не чем. Кстати, фильтров тоже не было, поэтому использовалась обычная стекловата, которой набивались сделанные из пипеток колонки.

Первые же эксперименты показали, что для отделения осадков наиболее критичным параметром является скорость фильтрования. Если она превышала 1. 1,5 мл/мин*см2, то ярко-синие осадки уходили в проскок. Но на малой скорости и при последовательном повышении концентраций окрашенные белки нарушали все известные теории — при достижении критической концентрации сульфата аммония растворимость ярко-синего фикоцианина падала до нуля, причём очень резко — при изменении насыщения раствора сульфатом аммония всего на 0,1-0,2%. Правда, испортить весь опыт могла даже небольшая вибрация рабочего стола. На синих белках это было очень хорошо заметно.

Для подтверждения подобного «аномального» высаливания фикоцианина был поставлен незасимый эксперимент — растворы с разной концентрацией сульфата аммония были приготовлены прямо в кюветах спектрофотометра, и образование осадков оценивалось по снижению оптической плотности раствора. Графики высаливания и в этом случае оказались аномальными — растворимость падала практически отвесно, но осадки вблизи точки высаливания были чрезвычайно лабильными — переходили опять в раствор даже при незначительных вибрациях, связанных с перемещением кювет.

Впоследствии такой характер высаливания был продемонстрирован и на гемоглобине крови. От экспериментов с кровью у меня до сих пор остался небольшой шрам на руке .

Основной вывод таков:
описанные в литературе формулы и кривые растворимости белков, обоснованые экспериментами на вибрирующих центрифугах, описывают не истинную картину высаливание белков, а устойчивость белковых осадков к вибрациям центрифуги .

Ну а следствия этого вывода и способы использования данного феномена для тонкой очистки белков с помощью высаливания постараюсь описать завтра. Сейчас уже пора убегать .

Форму Жизни я тоже благодарю Уважаю А Генсека стал еще больше уважать

Прикрепить сию полезную тему к методическому разделу форума!

Вот например сюда http://molbiol.ru/protocol/17_15.html ( http://molbiol.ru/protocol/17_15.html )

Похоже, пора от преамбулы переходить к амбуле — к хитростям, которые должен знать каждый начинающий высаливатель белков.

1. Кессонная болезнь, т.е. образование микропузырьков при растворении соли или при смешивании её насышенного раствора с водой. Это приводит к значительным потерям, поскольку осадки начинают всплывать, а часть белков в них необратимо денатурируется. При однократном высаливании этими потерями можно пренебречь, но при многократном высаливании теряется всё.

Проблема решается использованием для растворения осадков перед повторным их осаждением свежекипячёной («обезгаженной») воды.

2. Соосаждение, т.е. захват осадками белков, которые при данной концентрации соли ещё вполне растворимы.

Если высаливать белки повышением концентрации соли, то их соосаждение приводит к получению очень невнятных результатов. а вот если идти не снизу в верх, а сверху вниз, и проводить экстракционное высаливание, то с соосаждением можно бороться повторной экстракций.

В общих чертах экстракционное высаливание выглядит следующим образом:
а) к смеси белков в буфере добавить равный объём насыщенного раствора сульфата аммония (если начинать с 50% насыщения);
б) отцентрифугировать и слить супернатант в отдельную пробирку (фракция >50% насыщения);
в) осадок растворить в 5,5 мл «обезгаженной» воды и смешать с 4,5 мл насыщенного раствора сульфата аммония;
г) отцентрифугировать и слить супернатант в отдельную пробирку (фракция 45. 50% насыщения).
д) см. сказочку про попа и его собаку. Отличается только соотношение воды и раствора соли — 6:4; 6,5:3,5; 7:3.

При таком подходе можно повторять пункты в) и г) тем же соотношанием 5,5:4,5. При этом из осадка извлекаются белки, которые обязаны пребывать во фракции 45. 50%.

Ко всем полученным супернатантам (по 10 мл) можно добавить по 1 мл насыщенного раствора соли, получить осадки и провести повторное экстракционное высаливание с интервалом 1. 2% насыщения. Потери, связанные с соосаждением белков, будут уже намного меньше.

Кстати, чем чище препарат белка, тем меньше проявляются фокусы, связанные с соосаждением.

Продолжу завтра .

Класс! С нетерпением буду ждать продолжения
Но, если можно, поподробнее насчет субъединичных белков. Как вся эта роскошь работает с ними?
А то у меня в работе белок уже рефолдированный

Уважаемый genseq, извините за поздний ответ. Не всегда есть возможность воспользоваться интернетом. Все, что вы уже рассказали, безумно интересно! Сейчас постараюсь осознать собственные ошибки в работе и исправить положение. Если будет продолжение — всеми конечностями — за! Спасибо.

Боюсь, что девушки ждут молока от старого козла. Ну-ну. . Впрочем, на кое-что я ещё способен .

Как правило, при высаливании ориентируются на минимальную концентрацию сульфата аммония (процент насыщения), при которой требуемый белок выпадает в осадок. Более продвинутые специалисты предпочитают использовать интервал концентрации соли, который обычно составляет от 10 до 20% насыщения и очень редко — 5%. Метод считается очень грубым и используется на самой первой стадии, когда требуется избавиться от липидов, грубого дебриза, углеводов и низкомолекулярных примесей, способных загубить дорогостоящия колонки (см. форму жизни). При этом большие потери считаются нормой жизни.

В действительности всё совсем не так, как на самом деле. Высаливание пригодно и для грубой очистки (причём без особых потерь), и для тонкого фракционирования.

Для грубой очистки необходимо знать интервал насыщения, при котором белок выпадает в осадок (10. 20% насыщения). Основные потери связаны с соосаждением целевого белка, ну а способ борьбы с этим (повторное экстракционное высаливание) мы уже обсуждали. Впрочем, из каждого правила есть исключения — например, захват белка осадком может быть обусловлен и межмолекулярной сшивкой сульфгидрильных групп, но подобные фокусы и способы борьбы с ними нужно обсуждать отдельно.

Итак, после экстракционного высаливания грубого лизата (центрифугированного гомогената) с интервалом насыщения 10. 20% обычно получается белковый осадок кремового цвета, содержащий основную часть целевого белка и пригодный, например, для гель-хроматографии. После этого можно переходить к высаливанию с интервалом 2. 5%. Только не нужно забывать о том, что для каждого белка характерен не интервал, а точка высаливания, значение которой отличается исключительной стабильностью. Многократные центрифугирования (или фильтрования) необходимы только для максимально точного определения этой точки. В дальнейшем головной боли от жужжания центрифуги будет намного меньше.

Скорость формирования осадков при высаливании белков очень сильно зависит от их концентрации. Разведённые растворы ( /18.08.2007 08:10/

Кстати, о высаливании. Этот вопрос уже обсуждался на форуме:
http://molbiol.ru/forums/lofiversion/index.php/t152632.html ( http://molbiol.ru/forums/lofiversion/index.php/t152632.html )

Вопрос был сформлирован следующим образом:
Майя, 04.03.2007 07:36
скажите пожалуйста как влияет размер белка на эффективность его высаливания сернокислым аммонием, есть ли какая либо зависимость типа чем меньше белок тем хуже высаливается?

Ну а мой ответ не слишком сильно отличался от всего вышесказанного:

«Зависимость от размера есть, но не прямая. Лучше высаливаются кислые белки. Желательно работать при высокой концентрации белков. При низкой образование осадка идёт медленнее. По этой причине обычно рекомендуется использовать высаливание на самой первой стадии — для грубых экстрактов, содержащих большое количество примесей. При этом идёт сильное соосаждение, т.е. целевой белок захватывается осадком даже помимо своего «желания». Оптимальный вариант — это экстракционное высаливание, т.е. сначала осаждаете белок со всеми примесями, а потом растворяете осадок в дистиллированной воде и добавляете насыщенный раствор сульфата аммония в требуемой пропорции. Осадок растворяете и высаливаете повторно, но соотношение воды и соли понижаете, и т.д. Ко всем полученным супернатантам добавляете насыщенный раствор соли, центрифугируете и получаете серию осадков, в которых ищете свой белок. Если точка высаливания известна, то сразу ориентируетесь на требуемое соотношение воды и насыщенного раствора соли. Ступенчатую экстракцию можно проводить повторно и с различными интервалами процента насыщения раствора соли. Для крупных белков можно добиться осаждения в интервале 1. 2% насыщения, причём без существенных потерь. Для мелких интервал требуется немного шире (3. 5%).
Главное — дистиллированную воду брать только свежекипячёную. Иначе белки погибнут от «кессонной болезни».

Боюсь, что девушки ждут молока от старого козла. Ну-ну. . Впрочем, на кое-что я ещё способен .

Вот что меня безумно радует в мужчинах , так это их уникальное кокетство и способность напрашиваться на комплименты

Вообще-то это была самокритика .

Генсек, уже поздно — Яна уже втюрилась виртуально. Но вы же там соседи.

Во-первых, прошу не путать Яру с Яной, с детства этого не терплю
Во-вторых, таки да, «тащусь от зрелых мужей и мифических чудовищ» .
Ну что за инфантилизм: стоит даме сказать комплимент, как начинаются всякие инсинуации
В-третьих, мне лично лекция очень понравилась .

Уважаемый genseq. Завидую вашей удачливости. Вам удается растворять 1-2г белкового осадка в 5 мл воды (наверное, лучше все-таки буфера?). Увы, мне не везло с белками и растворы с концентрацией белко 100 мг/мл у меня не получаются. Наверное, мы недопонимаем друг друга. Я говорю о суммарном белке, концентрация которого измеряна (в соответствующем разведении, конечно) по Бредфорду или по Лоури. А вы о каком белке?
Кстати, об экстракции белков сульфатом. Все, что вы написали про переосаждение (по моему опыту) полностью соответстует получаемым мною результатам, за исключением растворимости белка. Обычно у меня не растворяется белковый сульфат-аммонийный осадок (например, из гомогената E.coli) в концентрации более 20 мг/мл.
Но есть весьма забавная модификация экстракции сульфатом. Для этого сначала вы высаживаете суммарный белок заведомо большей концентрацией (например, 0,8 насыщения, против 0,7, которое нужно для вашего белка). Отделяете осадок, супернатант (или фильтрат) отбрасываете, а осадок растворяете, но не в воде или в буфере, а в растворе сульфата аммония с концентрацией ниже той, которая необходима для высаливания вашего белка (например, 0,6 насыщения). Растворение лучше проводить ночь при +4 и соотношение осадок:раствор сульфата лучше брать 1:25 или 1:30. Полученную суспензию отцентрифугировать (или отфильтровать, если вам так привычнее) и теперь супернатант (или фильтрат) содержит ваш целевой белок с приличной очисткой. Добавьте к этому супернатанту опять сульфама аммония до нужной вам концентрации и получите очень приличную очистку целевого белка с небольшими потерями.

не думаю, что «уже поздно», но мне нравится ход твоих мыслей .

Спасибо форме жизни. Он совершенно прав, но я постараюсь быть ещё правее.

1. Белки, как правило, растворяют в буфере, предназначенном для поддержания заданного pH. Сульфат аммония — соль кислая. Её растворы имеют pH

5,0, а попытки защелочить их до привычного всем нейтрального или слабощелочного значения приводят к появлению аммиачной вони. Лучше просто не бояться кислых значений pH. Их денатурирующее воздействие на белки при высаливании, как правило, компенсируется повышением стабильности белков в концентрированных солевых растворах. Кстати, некоторые ферменты, плохо переносящие лиофилизацию (бета-галактозидаза и т.п.) хранятся и поставляются в виде суспензии в растворе сульфата аммония.

Скорее всего, из этого правила есть исключения. Тогда лучше использовать для высаливания забуференные растворы сульфата натрия или насыщенные растворы двузамещённого фосфата натрия (pH

2. Растворимость белков очень сильно зависит от ионной силы растворов. При низкой ионной силе растворимость многих белков незначительна, а если ещё и pH соответствует изоэлектрической точке белка, то он может вывалиться в осадок полностью. На этом основан метод изоэлектрического осаждения, активно использовавшийся на заре энзимологии. При повышении ионной силы растворимость быстро увеличивается и может достигать запредельных значений. Наконец, при приближении концентрации соли к точке высаливания растворимость снижается. Если белок очищенный, то она падает практически отвесно. Если очень «грязный», то график имеет куполообразных характер, сглаженный эфектами соосаждения.

Форма жизни совершенно прав. В буферном растворе многие белки растворяются весьма посредственно. Но вот сульфат-аммонийные осадки в небольшом объёме воды растворяются необычайно хорошо. Можно, конечно, растворять их и в небольшом объёме буфера, но это приведёт к непредсказуемости pH, так что лучше использовать именно воду. Будет, конечо, кисловато, но лучше так, чем иметь головную боль от непредсказуемой pH или от постоянного запаха аммиака .

В целом горячо одобряю, а вот в частности Вы описали несколько ухудшенную модификацию экстракционного высаливания. Ухудшение заключается в том, что при растворении осадка (фракции 80% насыщения) в растворе сульфата аммония (60% насыщения) потери целевого белка будут выше, чем при полном растворении осадка. Слишком много его останется в соосаждённом виде с белками фракции 0. 60%. Ну а как этого избежать мы уже рассматривали .

Ну ни тема, а учебник по высаливанию!
Огромное спасибо девушкам, без которых этого бы не было!

Среди нас только одна девушка — это Яра! Признаю. что Ярослава могла вдохновить мужчин на подвиги, а Генсека точно .

На форуме было по крайней мере три темы о высаливании. Сейчас они объединены в одну и эта тема прикреплена к методике высаливания в «Методах» (смотри первое сообщение в теме).

Прошу прощения, но мне бы хотелось сказать «несколько тёплых слов» Ирине, участвующей здесь под ником NBSC.

У неё очень непростая задачка — выделение в полевых условиях физиологически активного высоколабильного белка из гемолимфы, причём осаждается он при 70. 75% насыщения сульфата аммония. Основная задача — уменьшить потери, связанные как с высаливанием, так и с инактивацией.

Все белки сыворотки крови (и не только) на заре их препаративной химии были разделены на глобулины, осаждающиеся при 50% насыщения сульфата аммония, и альбумины, не выпадающие при этой концентрации соли в осадок. В соответствии с этой классификацией белок Ирины относится к альбуминам и является далеко не самым лучшим объектом для высаливания. Кроме того, известна только ориентировочная концентрация, при которой он выпадает в осадок (70. 75% насыщения). Попытаюсь дать несколько самых общих советов, в правильности которых не слишком уверен. Дело в том, что при высаливании подобных белков исключений может быть не меньше, чем правил.

1. Определите концентрацию соли (нижнюю границу), при которой белок ещё не выпадает в осадок, или частично выпадает, но может быть экстрагирован (см. выше разглагольствования о соосаждении). Если это 60% насыщения, то удастся избавиться от всех глобулинов и даже от значительной части альбуминов. Хорошо бы высолить основной альбумин вашей гемолимфы. При этом и потери могут быть незначительными (стабилизирующее влияние высоких концентраций соли), и очистка весьма ощутимой.
2. Попытайтесь как можно точнее найти концентрацию соли, при которой происходит полное высаливание Вашего белка (верхняя граница). Для этого используйте не сумарный препарат гемолимфы, а её фракцию, не выпавшую в осадок при подборе нижней границы.

Похоже, Ваша проблема ещё и в том, что даже при 75% насыщения есть подозрения, что значительная часть белка остаётся в супернатанте. С более высокими концентрациями соли работать уже слишком проблематично. В таком случае лучше перейти с высаливания на другие способы концентрирования (ультрафильтрация, обратный осмос и т.п.).

Кроме того, требуемой физиологической активностью могут обладать несколько белков. В этом случае получить достаточно внятные результаты при солевом фракционировании будет невозможно.

Существуют и индивидуальные особенности белков, мешающие их очистке при помощи высаливания. В общем, возможны проблемы , но из-за их непредсказуемости лучше сейчас не заморачивать Вам голову. Начните с поиска точного интервала высаливания, а там будет видно.

Добрый день! Уважаемые коллеги!
У нас достаточно гидрофобный белок. В состав лизирующего буфера входит мочевина. Можно ли как-то использовать метод высаливания? Совместимо ли использование мочевины с этим методом?

Вообще-то, заниматься сульфат-аммонийным фракционированием белков в полевых условиях дело очень сложное. Правда, понятие «полевые условия» довольно растяжимое и зависит от конкретного «поля». Выделение из гемолимфы — значит объект беспозвоночные, скорее всего моллюски, и следовательно, объем исходного материала весьма ограничен. Лучше всего «засолить» белок сульфатом, собрать осадок (можно фильтрацией), довести до лаборатории и там с ним работать.
Не бойтесь высолить белок «с запасом», сделайте 0,9-0,95 насыщения при +4 и после ночного перемешивания отфильтруйте белок. Только не пытайтесь «подсушить» осадок, пусть будет влажным — иначе белок денатурирует. Часто высаливание лучше проводить из буфера, содержащего ДТТ (дитиотрейтол). Если вам известно, что белок легко окисляется или есть какие-то предположения на этот счет, то 5мМ ДТТ могут облегчить жизнь.

Наличие мочевины в лизирующем буфере никак не мешает высаливанию белков. Только два замечания: 1) если концентрация мочевины в лизирующем буфере высокая, то уже свыше 0,5 насыщения сульфата белок будет флотировать. Это не страшно, но создает некоторые неудобства — надо ц\ф при более высоких оборотах чем обычно; 2) ваш белок из сульфат-аммонийного осадка скорее всего не будет растворяться в воде (буфере), если не добавить мочевины.
И еще имейте в виду, что присутствие мочевины изменит «точки высаливания» других белков, что для вас тоже может иметь значение.

Форма жизни, спасибо!

Форма жизни и genseq, спасибо! Ваша информация для меня очень важна.
У меня отработана методика получения нужного белка с помощью хроматографии после высаливания, с которой я работаю уже давно, но хочется попробовать еще и другие способы. Иногда получаются дополнительные варианты разделения.
Еще раз спасибо, отправляюсь на море работать. После возвращения напишу, помогло ли.

Извините за глупый вопрос: а почему Нуклеиновые кислоты сульфатом не высаживатся? Почему сульфат от них с таким же успехом воду не отнимает?

Нуклеиновые кислоты сильно гидрофильнее белка. Чтобы они выпали сами собой нужно либо добавить спирт. Либо создать специальные условия,например сильноразвитую поверхность, типа селикагеля, он же гласмилк.

Я так понимаю, что уже поздно что либо писать, но я Яна и реально существую на сайте уже давно, поэтому папрашу осторожнее с никами только на сайт захожу очень редко поэтому только сейчас прочитала про «инсинуации» в мой адрес. А за тему спасибо, несколько полезных идей для себя подчерпнула.

Высаливание биополимеров ингода преподносит удивительные сюрпризы. Лет 20 назад был опубликован и запатентован весьма оригинальный способ выделения ДНК из молок лососевых раб с помощью высаливания. Суть очень проста. Гомогенат молок обрабатывается сульфатом аммония до 0,9 насыщения по сульфату и полученный весьма мутный раствор разбавляется водой в 10 раз. Выпадает в осадок (точнее всплывает) ДНП — комплекс ДНК-протамин, который легко отделяется от всего остального фильтрованием или центрифугированием. Затем ДНП растворяют в 2 М NaCl и теперь уже чистую ДНК отфильтровывают от денатурированного белка и высаживают спиртом. Фактически идет «игра» на разной растворимости ДНК, белков и комплекса ДНК-протамин (ДНП) в растворах солей разной концентрации. На Хабаровском химфармзаводе даже было изготовлено несколько партий ДНК по этой технологии.

. либо цетавлон.

А вот как выяснилось да же без добавления спирта или участия сильноразвитой поверхности в осадок попадает низкомолекулярные НК уже при 70% от точки насыщения. Выпадают они сами по себе или по той причине что сами связыны с выпадающими белками-не проверялось, но теоритически в такой высокой ионной силе ионные взаимодействия неосуществимы, и если это действительно падение НК из-за связи с белком, то эти НК связаны с белками водородными связями. Короче так или иначе-падают НК при добавлении сульфата.

Что-то вас занесло. Возьмите любую ДНК, которую вам не жалко и попытайтесь ее высолить любой концентрацией сульфата. Увы, осадок не образуется. Поэтому ваше «выяснилось» это просто некорректно поставленный эксперимент.
Соосаждение нуклеиновых кислот с белками при сульфат-аммонийном фракционировании — это рядовое хорошо известное явление. Клеточный лизат или разрушеная ткань или еще какой-либо первичный биологический источник нужного вам белка (фермента) фракционируют сульфатом аммония, но при этом все понимают, что на начальном этапе ВСЕГДА происходит соосаждение НК, точнее соосаждаются фрагменты нуклеиновых кислот весьма гетерогенные по мольвесу и составу. При дальнейшей очистке от НК отделяются.
Так что не путайте, пожалуйста, разные понятия. Высальвание белков сульфатом и соосаждение нуклеиновых кислот белковыми сульфат-аммонийными осадками — это разные процессы.

=) Уважаемый критик, прочтите внимательно предпоследний пост:»в осадок попадает низкомолекулярные НК . Выпадают они сами по себе или по той причине что сами связыны с выпадающими белками-не проверялось».
«В осадок»-имеется ввиду осадок, обазующийся в клеточном лизате при добавлении к нему сульфата аммония.
Ясное дело что НК сульфатом из водного раствора не высадятся =), но вот то что не будет 100% очистки от них — показано.
Рад что факт соосаждения для вас-очевидная и общеизвестный процесс.

*поправочка: «то что не будет 100% очистки от них(НК) ПРИ ОСАЖДЕНИИ БЕЛКОВ КЛЕТОЧНОГО ЛИЗАТА — показано»
*очевидный

Здравствуйте!
У меня вопрос не профессионала, а человека всего лишь интересующегося.
При высаливании сульфатом аммония различных фракций белков из плазмы крови что происходит с липопротеинами, не осаждаются ли они, не изменяют ли своих свойств. В справочниках по биохимии ничего по этому поводу не нашла!
Заранее спасибо большое!

—не осаждаются ли они

—не изменяют ли своих свойств?

Строго говоря они их изменяют уже тогда, когда вы извлекли их из кровотока.
Но если подходить к этому вопросу грубо.
Не должны!