Уравнение фишера схема ферментативного процесса

Уравнение фишера схема ферментативного процесса

Во многих случаях скорость реакции резко изменяется в присутствии специальных веществ — катализаторов. Катализаторы участвуют в реакции, но в результате ее не расходуются. Катализаторы биологических процессов, протекающих в живых организмах, представляют собой белковые молекулы, которые называют ферментами, или энзимами.

Простейшая схема ферментативного катализа включает обратимое образование промежуточного комплекса фермента (E) с реагирующим веществом (субстратом, S) и разрушение этого комплекса с образованием продуктов реакции (P):

Применение квазиравновесного приближения к этой схеме (при условии k₂ > k₁). Применение этого метода к простейшей схеме катализа дает уравнение Михаэлиса-Ментен:

, (7.2)

где w_max = k₂ . [E]₀ — максимальная скорость реакции (при бесконечно большой концентрации субстрата),

— константа Михаэлиса. Эта константа равна концентрации субстрата, при которой скорость реакции равна половине максимальной скорости. Типичные значения K_M — от 10 -6 до 10 -1 моль/л. Константу скорости k₂ иногда называют числом оборотов фермента. Она может изменяться в пределах от 10 до 10 8 мин -1 .

Уравнение (7.2) можно записать в других координатах, более удобных для обработки экспериментальных данных:

(7.2а)

(координаты Лайнуивера-Берка) или

. (7.2б)

Для определения параметров K_M и w_max по уравнениям (7.2а) и (7.2б) проводят серию измерений начальной скорости реакции от начальной концентрации субстрата и представляют экспериментальные данные в координатах 1/w₀ ё 1/[S]₀ или w₀ ё w₀/[S]₀.

Иногда течение ферментативной реакции осложняется присутствием ингибиторов — веществ, способных образовывать комплексы с ферментом или фермент-субстратным комплексом. Различают конкурентное, неконкурентное и смешанное ингибирование.

При конкурентном механизме ингибитор (I) конкурирует с субстратом за активные участки фермента. Простейшая кинетическая схема данного процесса имеет вид:

Применение квазистационарного приближения к комплексу ES и квазиравновесного приближения к комплексу EI с учетом уравнений материального баланса [E] + [ES] + [EI] = [E]₀ и [I] » [I]₀ дает для скорости реакции уравнение типа (7.2):

, (7.3)

где эффективная константа Михаэлиса связана с исходной концентрацией ингибитора:

; (7.3а)

Величину K_I = [E]. [I] / [EI], которая представляет собой константу диссоциации комплекса фермента с ингибитором, называют константой ингибирования. Таким образом, при конкурентном ингибировании увеличивается константа Михаэлиса, а максимальная скорость ферментативной реакции остается неизменной.

При неконкурентном механизме ингибитор обратимо связывает промежуточный комплекс фермента с субстратом. Простейшая кинетическая схема данного процесса имеет вид:

,

где предполагается, что константы диссоциации комплексов EI и ESI одинаковы: [E]. [I] / [EI] = [ES]. [I] / [ESI] = K_I. Применение квазистационарного приближения к комплексу ES и квазиравновесного приближения к комплексам EI и ESI с учетом уравнений материального баланса [E] + [ES] + [EI] + [ESI] = [E]₀ и [I] » [I]₀ дает для скорости реакции уравнение типа (7.2):

, (7.4)

где эффективная максимальная скорость связана с начальной концентрацией ингибитора выражением:

. (7.4а)

При неконкурентном ингибировании максимальная скорость реакции уменьшается, а константа Михаэлиса остается неизменной.

Смешанное ингибирование описывается более сложными кинетическими схемами. При смешанном ингибировании изменяются и константа Михаэлиса, и максимальная скорость ферментативной реакции.

Пример 7-1. Найдите константу Михаэлиса и максимальную скорость гидролиза аденозинтрифосфата, катализируемого миозином, по следующим кинетическим данным:

Решение. Уравнение Михаэлиса-Ментен в данных координатах имеет вид (7.2б), следовательно, точки пересечения с осями имеют координаты: (0;w_max) для оси ординат, (w_max/K_M;0) для оси абсцисс. Первая точка пересечения дает значение w_max = 2.1 . 10 -6 моль/(л. с). Вторая точка позволяет найти константу Михаэлиса: w_max/K_M = 14.6 . 10 -3 с -1 , K_M = 2.1 . 10 -6 / 14.6 . 10 -3 = 1.44 . 10 -4 моль/л.

Пример 7-2. Ферментативная реакция (K_M = 2.7 . 10 -3 моль/л) подавляется конкурентным ингибитором (K_I = 3.1 . 10 -5 моль/л). Концентрация субстрата равна 3.6 . 10 -4 моль/л. Сколько ингибитора понадобится для подавления реакции на 65%? Во сколько раз надо повысить концентрацию субстрата, чтобы уменьшить степень подавления до 25%?

Решение. 1) Конкурентное ингибирование описывается формулами (7.3) и (7.3а). 65%-ное подавление реакции означает, что скорость ингибируемой реакции составляет 35% от скорости реакции в отсутствие ингибитора:

,

откуда следует, что

.

В этой формуле известны значения K_M, K_I и [S]. Концентрация ингибитора равна:

6.5 . 10 -5 моль/л.

Уменьшение степени ингибирования до 25% означает, что скорость ингибируемой реакции составляет 75% от нормальной:

,

где в данном случае известны K_M, K_I и [I]₀. Отсюда можно выразить искомую концентрацию субстрата:

1.4 . 10 -2 моль/л.

Таким образом, для уменьшения степени ингибирования до 25% концентрацию субстрата надо увеличить в 1.4 . 10 -2 / 3.6 . 10 -4 = 40 раз.

7-1. Гидролиз ацетилхолина катализируется ферментом ацетилхолинэстеразой, число оборотов которой составляет 25000 с -1 . Сколько времени потребуется ферменту для расщепления одной молекулы ацетилхолина? (ответ)

7-2. Для некоторой ферментативной реакции константа Михаэлиса равна 0.035 моль/л. Скорость реакции при концентрации субстрата 0.110 моль/л равна 1.15 . 10 -3 моль/(л. с). Найдите максимальную скорость этой реакции.(ответ)

7-3. Начальная скорость окисления сукцината натрия в фумарат натрия под действием фермента сукциноксидазы была измерена для ряда концентраций субстрата:

0.0005

0.00033w . 10 6 , моль/(л. с)

Определите константу Михаэлиса данной реакции.(ответ)

7-4. Начальная скорость выделения O₂ при действии фермента на субстрат была измерена для ряда концентраций субстрата:

0.002w, мм 3 /мин

Определите константу Михаэлиса данной реакции.(ответ)

7-5. Найдите константу Михаэлиса и максимальную скорость каталитического разложения гидроперекиси тетралина по следующим кинетическим данным:

7-6. Найдите константу Михаэлиса и максимальную скорость каталитического окисления циклогексена трет-бутилпероксидом по следующим кинетическим данным:

7-7. Найдите константу Михаэлиса и максимальную скорость гидролиза карбобензилоксиглицилфенилаланина под действием карбоксипептидазы по следующим кинетическим данным:

7-8. Рассчитайте концентрацию неконкурентного ингибитора I (K_I = 2.9 . 10 -4 моль/л), необходимую для 90%-ного подавления ферментативной реакции.(ответ)

7-9. В некоторых случаях кинетические исследования ферментативных реакций проводят в условиях избытка фермента. Выведите уравнение Михаэлиса-Ментен, описывающее зависимость начальной скорости ферментативной реакции от начальных концентраций фермента и субстрата в системе

при условии, что концентрация фермента намного больше концентрации субстрата.(ответ)

*7-10. Рассмотрите механизм ферментативного катализа с двумя промежуточными комплексами:

Используя метод квазистационарных концентраций и уравнение материального баланса, покажите, что скорость реакции описывается уравнением типа Михаэлиса-Ментен (7.2). Найдите выражения для эффективной максимальной скорости и эффективной константы Михаэлиса через константы скорости отдельных стадий.(ответ)

7-11. Запишите уравнения конкурентного и неконкурентного ингибирования в координатах Лайнуивера-Берка. Представьте эти уравнения в графическом виде для трех разных начальных концентраций ингибитора (включая [I]₀ = 0). Объясните, как можно определить константу ингибирования.(ответ)

7-12. Запишите уравнения конкурентного и неконкурентного ингибирования в координатах w₀ w₀/[S]₀. Представьте эти уравнения в графическом виде для трех разных начальных концентраций ингибитора (включая [I]₀ = 0). Объясните, как можно определить константу ингибирования.(ответ)

*7-13. Рассмотрите схему неконкурентного ингибирования с разными константами диссоциации комлпексов:

Используя квазистационарное приближение для ES и квазиравновесное приближение для EI и ESI, найдите начальную скорость реакции. Как связаны максимальная скорость реакции и константа Михаэлиса с соответствующими величинами для неингибируемой реакции?(ответ)

Сервер создается при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований
Не разрешается копирование материалов и размещение на других Web-сайтах
Вебдизайн: Copyright (C) И. Миняйлова и В. Миняйлов
Copyright (C) Химический факультет МГУ
Написать письмо редактору

Механизм и стадии ферментативного катализа

Химическая реакция – это результат столкновения молекул, которые зависит от величины энергии молекул и от прочности той связи между атомами в молекуле, которая должна быть разорвана. Молекул с очень низкой и очень высокой энергией мало, большинство молекул обладает средним запасом энергии. Они и определяют скорость реакции.

Способы ускорения химических реакций:

1.увеличить среднюю энергию молекул;

2.снизить энергетический барьер реакции.

Энергетический барьер реакции –это значение энергии когда все молекулы взаимодействуют.

Энергия активации –количество энергии, необходимое для того, чтобы все молекулы смогли прозаимодействовать, т.е. преодолеть энергетический барьер.

В общем виде уравнение химической реакции в присутствии фермента можно записать

E + S↔ES↔EZ→EP→E+P,

гдеЕ – фермент, S – субстрат,Р – продукт, Z – промежуточный комплекс.

Ферментативная реакция протекает в три стадии:

Ι стадия: Е + S↔ЕS – образование фермент — субстратного комплекса. Протекает очень быстро. Субстрат присоединяется к якорному участку активного центра.

В 1894 году Фишер предложил модель взаимодействия фермента с субстратом «Ключ – замок», т.е. субстрат подходит к ферменту как ключ к замку.

Согласно этой модели у фермента имеется окончательно сформированный активный центр. Ещё задолго до взаимодействияс субстратом. Эта модель объясняла абсолютную специфичность фермента и не могла объяснить относительной, поэтому Кошланд предложил модель «Индуцированного соответствия».Согласно этой модели, окончательное формирование активного центра ферментапроисходит в момент взаимодействия с субстратом т.е. при связывании субстрата с якорным участком активного центра происходит изменение конформации каталитического участка активного центра, обеспечивающее его комплементарность поверхности субстрата.

Причины ускорения реакции на первой стадии:

1. Происходит сближение и правильная ориентация молекул субстрата в области активного центра фермента.

2. Это приводит к увеличению эффективной концентрации молекул субстрата, т.е. тех молекул которые взаимодействуют, так как в растворе без фермента их столкновения были случайными.

Стадия:на стадии фермент — субстратного комплекса происходит химическая реакция через переходное состояние ES↔EZ,где Z – это уже не субстрат но ещё и не продукт. Именно эта стадии лежит в основе субстратной специфичности фермента. Неспецифические взаимодействия субстрата с ферментом нарушаются при образовании переходного состояния, при специфическом взаимодействии на стадии переходного состояния происходит резкое увеличение скорости реакции. На этой стадии происходит ускорение реакции вследствие уменьшения энергии активации.

Причины снижения энергии активации:

1. Фермент передает часть своей энергии субстрату в ходе взаимной подгонки конформации субстрата и фермента. Субстрат в ходе взаимодействия с активным центром фермента деформируется, что облегчает разрыв его связей.

2. Уменьшается энергетический барьер реакции путем разбивки её на ряд промежуточных стадий, каждая из которых имеет низкий энергетический барьер.

ΙΙΙ стадия: EP → E + Pреакция происходит быстро, выделяется продукт реакции, а фермент выделяется в неизменном количестве и качестве.

Факторы влияющие на скорость ферментативных реакций:

Кинетика и термодинамика ферментативных реакций (стр. 1 )

Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах: 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Министерство образования и науки Российской Федерации

Сибирский федеральный университет

Кинетика и термодинамика ферментативных реакций

к практическим занятиям

Специальность 020208.65 — Биохимия

Кинетика и термодинамика ферментативных реакций: Сборник задач к практическим занятиям /[Текст] / сост. . – Красноярск: Сиб. федер. ун-т, 2012. – 64 с.

Сборник задач по курсу «Кинетика и термодинамика ферментативных реакций» составлен в соответствии с программой курса и является учебно-методическим руководством по решению задач по кинетическим свойствам ферментов.

В учебном пособии представлены четко структурированные задачи по основному разделу курса «Кинетика ферментативных реакций» разной степени сложности. Предназначено для студентов биологических и медико-биологических специальностей университетов.

В ферментативной кинетике концепция стационарности применима к концентрациям связанных с ферментом интермедиатов. Когда фермент смешивается с избытком субстрата наблюдается начальный период, известный как предстационарное состояние, в течение которого концентрации этих интермедиатов достигают стационарного уровня. По достижении интермедиатами стационарных концентраций скорость реакции относительно медленно изменяется со временем и именно в данный период традиционно измеряют скорости энзиматических реакций.

Стационарное состояние является аппроксимацией, поскольку субстрат постепенно превращается в ходе эксперимента. Но, принимая во внимание, что измерения осуществляются за короткий промежуток времени, когда концентрация субстрата изменяется незначительно, стационарное состояние является хорошей аппроксимацией. Хотя изучение предстационарной кинетики позволяет анализировать механизмы ферментативного катализа, стационарная кинетика более важна для измерения каталитической активности фермента при стационарных состояниях в клетке.

Раздел 1. Уравнение Михаэлиса-Ментен

Браун (Brown A. J.) и затем В. Анри (Henri V.) в начале ХХ века высказали предположение о том, что в основе ферментативной реакции лежит обратимое взаимодействис субстрата с ферментом с образованием комплекса, который далее распадается с образованием продуктов реакции и регенерацией исходного фермента. Эта гипотеза была далее развита в работах Михаэлиса (L. Michaelis) и Ментен (M. L. Menten) (1913 г.) и позднее – Бригсом (G. E. Briggs) и Холденом (J. B.S. Haldane) (1925 г.).

Кинетическую схему простейшей односторонней ферментативной реакции превращения одного субстрата в продукт можно представить следующим образом:

(1.1)

Ферментативная реакция протекает в два этапа. На первом этапе фермент и субстрат образуют фермент-субстратный комплекс ES. Этот этап является быстрым и обратимым, он не сопровождается какими-либо химическими изменениями субстрата. Константы скорости реакции образования фермент-субстратного комплекса и обратного его распада равны соответственно k+1 и k-1. В образовании фермент-субстратного комплекса (ФСК, комплекс Михаэлиса) принимают участие нековалентные взаимодействия.

Каталитический процесс осуществляется на втором этапе реакции с константой первого порядка k+2 (kcat, число оборотов фермента). Комплекс Михаэлиса распадается с образованием конечного продукта реакции Р и регенерацией исходного фермента. Распад фермент-субстратного комплекса может происходить по-разному: в данной кинетической схеме он распадается в одну стадию, но в других случаях этих стадий может быть несколько.

Исходя из уравнения (1), можно расписать уравнения для скоростей отдельных стадий реакции.

Скорость образования фермент-субстратного комплекса:

.

Скорость обратной реакции (диссоциации комплекса на исходные вещества):

.

Скорость распада комплекса ES с образованием продуктов реакции и регенерацией фермента:

.

Стационарное течение процесса возможно тогда, когда концентрация субстрата существенно превосходит концентрацию фермента ([S]>> [E]). В этом случае распад комплекса ES по реакциям (+2) и (-1) уравновешивается его образованием по реакции (+1). Поэтому для условия стационарности можно записать:

.

Обозначив общую концентрацию фермента через [E]0, при условии, что [E]0 = [E] + [ES], преобразуем предыдущее уравнение

.

Откуда концентрация фермент-субстратного комплекса будет равна

.

,

.

Скорость ферментативной реакции, измеряемая согласно схеме (1) по образованию продукта реакции Р из комплекса ES, может быть выражена следующим образом

.

Подставляя в это выражение найденное значение [ES], получаем

Данное уравнение отражает зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации фермента и субстрата. Константа Км носит название константы Михаэлиса и имеет размерность концентрации субстрата. Уравнение (2) свидетельствует, что зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата при [E]0=const является гиперболической функцией (рис. 1.1).

Рис.1.1. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата

Кривая представляет собой равнобочную гиперболу. При достаточно малых концентрациях субстрата, когда [S] > Км, можно принять, что Км + [S] ≈ [S], и тогда

а реакция имеет нулевой порядок по отношению к субстрату. Следовательно, при достижении определенной концентрации субстрата скорость ферментативной реакции достигает максимального значения Vmax и при дальнейшем увеличении концентрации субстрата не изменяется.

Смысл такого рода зависимости очевиден: скорость ферментативной реакции определяется в целом концентрацией фермент-субстратного комплекса и при малых концентрациях субстрата концентрация комплекса Михаэлиса пропорциональна [S], тогда как при избытке субстрата фактически весь фермент находится в форме ES. Дальнейшее повышение концентрации субстрата не приводит к увеличению [ES].

С учетом приведенного выше выражения, окончательное уравнение зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации фермента и субстрата приобретает вид

. (1.3)

Уравнение (3) является фундаментальным уравнением ферментативной кинетики и обычно называется уравнением Михаэлиса-Ментен.

Скорость реакции приближается к максимальной достаточно медленно, и даже при [S]= 10Км, величина скорости достигает только 0,91 Vmax. В связи с этим значение максимальной скорости очень часто трудно измеримо и его приходится рассчитывать из скоростей, наблюдаемых при концентрациях субстрата ниже насыщающих.

1.1. Характеристика кинетических констант

В уравнении Михаэлиса есть два кинетических параметра, имеющих важное значение для характеристики любого фермента. Это константа Михаэлиса и максимальная скорость реакции. Константа Михаэлиса определяется соотношением констант (k—1+k+2/k+1), а величина Vmax, называемая максимальной скоростью, ‒ произведением k+2 [E]0.

Константа Михаэлиса численно равна концентрации субстрата, при которой начальная скорость ферментативной реакции равна половине максимальной. Высокое сродство фермента к субстрату характеризуется низкой величиной Кm и наоборот, низкое сродство – высокой величиной Км.

Величина Vmax не является фундаментальной характеристикой фермента, поскольку зависит от его концентрации. Если концентрация фермента известна, то целесообразно ввести величину kcat – каталитическую константу (или число оборотов фермента), определяемую выражением Vmax/[E]0. Для механизма Михаэлиса kcat идентична k+2, однако в общем случае лучше пользоваться менее определенным обозначением, а именно kcat.

Константу kкат называют еще «числом оборотов» поскольку она соответствует числу молекул субстрата, превращаемых в продукт одной молекулой фермента за 1 с. Отношение констант kcat/Км называют константой специфичности фермента.

1.2. Методы определения Км и Vmax

Константу Михаэлиса можно определить из графика Михаэлиса (рис.1.1), найдя графическим способом максимальную скорость и соответствующую величину концентрации субстрата, при которой скорость ферментативной реакции будет вдвое меньше Vmax. Эта величина [S] и будет Км. Таким способом можно определить только приблизительную величину константы Михаэлиса из-за трудности точного графического определения Vmax.

Более удобными являются методы, в которых осуществлена линеаризация уравнения Михаэлиса-Ментен, т. е. гиперболическая зависимость v от [S] переведена в линейную.

Для того чтобы построить такой график, необходимо определить в одинаковых условиях при различных концентрациях субстрата и [E]= const начальные скорости ферментативной реакции.

Метод Лайнуивера-Берка. Один из способов линеаризации уравнения Михаэлиса-Ментен предложили Лайнуивер и Берк (Lineweaver H., Burk D.)). Это так называемый метод двойных обратных величин. Для линеаризации необходимо взять обратные величины от левой и правой частей уравнения (), в результате чего оно преобразуется в уравнение вида

согласно которому между величинами, обратными начальной скорости (1/v, v-1) и концентрации субстрата (1/[S], [S]-1) соблюдается линейная зависимость, если механизм реакции подчиняется изложенным выше представлениям (рис.1.2).

Рис. 1.2. График зависимости 1/v от 1/[S] (график Лайнуивера-Берка)

Экспериментальная прямая пересекает ось абсцисс в точке (-1/[S] = 1/Км), а ось ординат – в точке (1/v = 1/Vмах). Тангенс угла наклона равен Км/Vмах. Этим широко пользуются для определения параметров Км и Vмах, характеризующих связывающую и каталитическую функции ферментов.

Метод Хайнса-Вульфа. В этом случае преобразуется уравнение Лайнуивера-Берка путем умножения правой и левой частей на концентрацию субстрата.

Графическая зависимость приведена на рис.1.3.

Рис. 1.3. График зависимости [S]/v от [S] (график Хайнса-Вульфа)

Это прямая с наклоном 1/Vmax, отсекающая на осях [S]/v и [S] отрезки Км/ Vmax и – Км соответственно.

Метод Иди-Хофсти. При одном из таких графических преобразований в так называемом графике Иди-Хофсти (pиc.2.3.5) строят график зависимости v от v/[S]. В этом случае точка пересечения прямой, полученной путем наилучшей линейной аппроксимации экспериментальных точек, с осью ординат соответствует Vmax, а тангенс угла наклона равен – Km. Данный способ линеаризации приведен на рис. 1.4.

Рис. 1.4. График зависимости v от v/[S] (график Эди-Хофсти)

Метод Эйзенталя и Корниш-Боудена. Много позднее Эйзенталь и Корниш-Боуден предложили иной метод графического представления результатов исследования кинетики ферментативных реакций – так называемый прямой линейный график. Уравнение Михаэлиса-Ментен они преобразовали в виде зависимости Vmax от Км:

Для любой пары значений [S] и v можно построить зависимость Vmax от Км. Она представляет прямую с наклоном, равным v/[S], и отрезками, отсекаемыми на осях Км и Vmax, соответственно равными – [S] v. Если провести прямые для нескольких пар значений [S] и v, то эти прямые пересекутся в одной точке, координаты которой дадут единственные значения Vmax от Км, удовлетворяющие всем парам значений [S] и v (рис.1.5).

Рис.1.5. Определение кинетических констант – Км и Vmax по методу Эйзенталя и Корниш-Боудена

Преимущества такого графика очевидно: для его построения не требуется никаких расчетов, он позволяет очень просто выявить ошибочные данные (такие прямые будут выпадать из основной совокупности прямых).

Уравнение Михаэлиса лежит в основе всех кинетических исследований ферментативных реакций, так как оно позволяет рассчитать количественные характеристики ферментов и проводить анализ их ингибирования. Величины Кm и Vmax являются важнейшими характеристиками ферментов и их можно определить, используя линеаризованные формы уравнения Михаэлиса-Ментен.

Графические методы для определения Vmax и Кm не являются оптимальными. В настоящее время данные ферментативной кинетики обрабатывают быстрее и более объективно с помощью компьютерных программ.

1.3. Задачи к разделу 1

Задача 1.1.. Определить кинетические параметры реакции, катализируемой фосфоглюкомутазой, исходя из данных, приведенных в табл.1.