Уравнение калибровочного графика рассчитывают методом

Методические указания для обучающихся к практическому занятию для аудиторной работы, тема: «Построение калибровочных графиков»

ГОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет

Федерального агентства по здравоохранению и социальному развтию»

Кафедра Клиничео-лабораторной диагностики

К ПРАКТИЧЕСКОМУ ЗАНЯТИЮ для аудиторной работы

Тема: «Построение калибровочных графиков»

Утверждена на кафедральном заседании

(межкафедральной методической конференции)

«_____»__________________ 2010 г.

ГОУ ВПО КрасГМУ им. проф. -Ясенецкого

к. м.н., доцент _______________________

к. м.н., доцент _____________________

Учебная цель: Познакомить курсантов с правилами построения калибровочных графиков, методами расчета контрольных точек и способам проверки построенного графика.

На практических занятиях: специально разработанные задачи для закрепления на практике полученной теоретической базы.

Практические навыки, которыми должен владеть курсант

Вычисление точек для построения калибровочного графика двумя способами

Знание методики проверки калибровочного графика

Знание основных принципов использования калибровочного графика

На цикле общего усовершенствования определить базовый уровень знания предмета, оценить умение курсанта находить наиболее верную тактику использования калибровочного графика в сложных ситуациях, которые могут создаться на рабочем месте.

На цикле ППС подробно разобрать требования к калибровочным материалам и правила их приготовления. Отработать на специальных примерах принципы построения калибровочного графика и способы расчета калибровочных растворов, и способы проверки правильности построения калибровочной кривой. В конце занятия проверить степень усвоения разобранной темы и подробнее остановиться на вызвавших затруднение вопросах.

При подготовке к занятию прочитать всю доступную литературу по данной теме, а в методическом кабинете проработать разработанное на кафедре учебное пособие. Самостоятельно используя стандартные наборы различных производителей рассчитать разными способами точки для построения калибровочной кривой, ответить на все контрольные вопросы которые приводятся в конце данного пособия. Если возникли какие-либо затруднения сформировать логически вопрос и задать его преподавателю на практическом занятии либо в начале, либо по ходу разбора темы.

1. Количественные проблемы биохимии, М. 1983

2. Унификация лабораторных методов исследования. Стандартизация качества унифицированных клинических лабораторных методов исследования, М., 1981.

3. Лабораторное дело, 1977, №4, 253.

4. Камышников по клинико-биохимической лабораторной диагностике: В 2т. т.1 – Мн.: Беларусь, 2000. – 495 с.: ил.

В основе всех колориметрических методов положено светопропускание и светопоглащение. Приборы, используемые в фотометрическом анализе позволяют определить оптическую плотность и процент светопропускания. Но в отделение выдается результат исследования не в единицах оптической плотности, а в единицах концентрации. Экстинция исследуемого образца сравнивается с экстинцией образца компонента с точно известной концентрацией. Расчеты ведут по формуле или калибровочному графику.

Калибровочный график – это графическое изображение связи между измеряемой величиной экстинцией и концентрацией вещества.

Методы исследования, в основе которых лежит сравнение с образцом являются методами сравнения и их точность зависит от точности приготовления калибровочных растворов и чистоты веществ.

Характеристика калибровочных материалов

Для получения воспроизводимых, контролируемых, статистически достоверных и сравниваемых результатов существует система измерений, включающая методологию и соответствующие вещества контролируемого состава. Экспертная группа по номенклатуре качественного контроля предлагает разделить калибровочные стандарты на группы:

— первичные – в которой масса стандартного вещества определяется взвешиванием;

— вторичные – содержание компонентов определяется аналитическим методом.

Требования к первичному стандарту

1. Вещество должно быть стабильным.

2. Вещество должно иметь точно установленный состав.

3. Вещество должно иметь высокий эквивалентный вес, чтобы при взвешивании ошибка была минимальной.

4. Вещество не должно изменяться при очистке, сушке и т. д.

Этим требованиям в настоящее время соответствуют не все вещества, в основном неорганические.

В качестве калибровочных материалов могут использоваться вещества различной природы и степени чистоты, в зависимости от поставленных задач.

Правила при приготовлении калибровочных растворов

1. Используемое вещество должно быть максимально возможной чистоты с максимум содержания основного вещества – более 99,9 %. Чем чище вещество, тем оно стабильнее.

Например: есть вещества степени чистоты хч, чда, ч. Берем хч.

2. Навеска отвешивается с большой точностью на аналитических весах (в ряде случаев допустимо использование торсионных весов), но всегда в таре, с которой вещество можно смыть растворителем.

3. Навеска должна быть довольно большой, чтобы повысить точность взвешивания. Если по методике требуется слабый раствор, то готовят более концентрированный, а затем его разбавляют. Чем больше навеска – тем выше точность.

4. Иногда в методике есть специальные указания (например: высушить до постоянного веса и т. д.). Сушить можно прокаливанием, в термостате, в эксикаторе, выветриванием. Нужно посмотреть по химическому справочнику термоустойчивость вещества. Обязательно взвешивание до и после высушивания.

Нельзя готовить калибровочные растворы из гигроскопичных веществ.

5. Навеска тщательно смывается и растворяется в растворителе высокой чистоты. Вода должна быть свежеприготовленной, лучше (а для ряда методик только) бидистиллированной. При построении калибровочных кривых правильнее использовать не водные растворы, а стандартные сыворотки разного состава. Эти сыворотки самими не готовятся. Водные растворы хуже, так как при ряде исследований присутствующие в сыворотке белки оказывают определенное влияние – часть вещества может сорбироваться на белке и не участвовать в химической реакции — так называемый «матричный эффект». Например, в методике определения билирубина для калибровочного раствора берут сыворотку, так как билирубин в воде не растворяется, а растворенный в щелочи дает меньшую экстинцию.

Альбуминосодержащие калибровочные растворы следует применять в случаях, когда это указано в методике или если необходимо проверить влияние белка на надежность метода.

Диапазон стандартных растворов

Для любой исследуемой величины есть средняя величина, верхняя и нижняя граница норм, а при патологии может быть гипо — и гиперсодержание. Следовательно, в графике должны быть отражены все эти точки. Большое значение имеет чувствительность метода. Она определяется той наименьшей концентрацией вещества, которое еще может быть определено с достаточной точностью.

То есть концентрации веществ должны быть адоптированы к пределам нормы и чувствительности метода, и график обычно включает не менее 4-5 точек.

-Х—— средняя величина

При проверке надежности метода, кроме того, следует определить:

-прямолинейность выше максимальной точки калибровочной кривой;

-прямолинейность между нулевой точкой и минимальной на калибровочной кривой. Для этого готовят еще по 3 точки (эквидистантные концентрации).

Для каждой выбранной точки готовят калибровочный раствор, который обрабатывают по методике в параллельных пробах (не менее 2-3), на график наносится среднее значение.

Общие требования

1. Разведение стандартного раствора готовят в арифметической, а не геометрической прогрессии, выдерживая 1 шаг: 0,1 мг, 0,2 мг, 0,3 мг и т. д.

2. При измерении оптических плоскостей следует учитывать оптическую плотность реактивов, иначе точка не пройдет через 0. Для этого колориметрируют против контроля, содержащего все реактивы.

Оптическую плотность, полученную для калибровочных растворов, наносим на систему координат. Лучше всего пользоваться миллиметровой бумагой достаточно большого размера. По оси ординат откладывается плотность, по оси абсцисс – концентрация. Масштаб выбирается произвольно: для концентраций – чтобы можно было считать с точностью, соответствующей практическим требованиям с учетом пределов нормы и чувствительности метода; для экстинции – учитывая цену деления прибора. Оптимально, когда наклон кривой к оси абсцисс проходит под углом 450. При малом масштабе угол будет больше и кривая более крутая, при большем масштабе – кривая проходит более полого.

Если в пределах выбранных концентраций растворы соответствуют закону Ламберта-Бера, то график проходит через 0 точку и имеет вид прямой.

Всегда ли кривая в выбранном диапазоне концентраций проходит через точку 0? Нет, не всегда, даже если кривая правильная. Это может быть: 1. если реакция при больших и малых концентрациях протекает не строго стериохимически; 2. если исследование ведется не в монохромном свете. Надо перейти на другой прибор.

НО ВСЕГДА НАДО РАБОТАТЬ НА ЛИНЕЙНОМ УЧАСТКЕ КРИВОЙ.

Иногда это невозможно. Например, при определении белка по Лоури, где кривая очень быстро выходит на плато. В этом случае строят графическую калибровочную кривую. Кроме основных калибровочных растворов, проходящих по прямолинейному участку, берут не менее 10 стандартных растворов, проходящих по прямолинейному участку, берут не менее 10 стандартных растворов, соответствующих пологому участку. Т. е. на пологом участке будет много точек.

Приготовление калибровочных растворов

Из основного калибровочного вещества готовят ряд стандартных проб. Они могут быть приготовлены 2-мя способами, в зависимости от биохимии метода.

1 способ: Необходимая концентрация стандартного раствора обеспечивается за счет различных объемов одного и того же маточного (основного) стандартного раствора.

Построение калибровочных графиков и их применение.

Обращаем Ваше внимание, что в соответствии с Федеральным законом N 273-ФЗ «Об образовании в Российской Федерации» в организациях, осуществляющих образовательную деятельность, организовывается обучение и воспитание обучающихся с ОВЗ как совместно с другими обучающимися, так и в отдельных классах или группах.

Построение калибровочных графиков и их применение.

Предварительно необходимо подготовить посуду — мерные колбы, пробирки, пипетки, реактивы и растворы.

Для построения калибровочного графика готовят серию стандартных растворов, охватывающих диапазон измеряемых концентраций исследуемого вещества согласно методике.

Калибровочный график строят по 5-6 сериям шкал; количество концентраций в каждой шкале должно быть не мене 5. Резко отличающиеся значения оптической плотности не учитывают. Из остальных рассчитывают среднее арифметическое значение для каждой концентрации и строят график зависимости оптической плотности от концентрации вещества (рисунок 14).

Примерный размер графика 20-25×30 см; прямая должна проходить через начало координат под углом приблизительно 45°. В идеальном случае все точки располагаются на прямой, обычно часть точек располагается на прямой, часть выше и ниже ее, точки как бы чередуются.

На графике должны быть указаны условия фотометрирования: номер светофильтра или длины волны (нм); размер кюветы (мм); время фотометрирования. Кроме того, должна быть указана дата построения калибровочного графика. Калибровочный график необходимо периодически проверять по 2-3 концентрациям.

Наиболее распространенными приборами являются фотоэлектроколориметр ФЭК-56М, колориметр фотоэлектрический однолучевой КФО, колориметр фотоэлектрический концентрационный КФК-2 (рисунок 15), КФК-2МП с микропроцессорной системой «Электроника» и спектрофотометр СФ-46 (таблица 2).

Таблица 2 — Технические данные фотометрических приборов

Спектральный диапазон, нм

Надежность результатов измерений при работе на фотоэлектроколориметрах и спектрофотометрах обеспечивается, правильной установкой и эксплуатацией приборов. Поэтому приступать к измерениям можно только после тщательного ознакомления с описанием устройства прибора и правил его эксплуатации.

Прямое фотометрическое определение железа

Большие содержания железа

Построение калибровочного графика для прямого

фотометрического определения железа

Методические указания для обучающихся к практическому занятию для аудиторной работы Тема: «Построение калибровочных графиков»

Главная > Методические указания

ГОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет

Федерального агентства по здравоохранению и социальному развтию»

Кафедра Клиничео-лабораторной диагностики

К ПРАКТИЧЕСКОМУ ЗАНЯТИЮ для аудиторной работы

Тема: « Построение калибровочных графиков »

Утверждена на кафедральном заседании

(межкафедральной методической конференции)

«_____»__________________ 2010 г.

Зав. кафедрой клинической лабораторной диагностики

ГОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого

к.м.н., доцент _______________________ Анисимова Е.Н

к.м.н., доцент _____________________ Бабушкин В.А.

Учебная цель: Познакомить курсантов с правилами построения калибровочных графиков, методами расчета контрольных точек и способам проверки построенного графика.

На практических занятиях: специально разработанные задачи для закрепления на практике полученной теоретической базы.

Практические навыки, которыми должен владеть курсант

Вычисление точек для построения калибровочного графика двумя способами

Знание методики проверки калибровочного графика

Знание основных принципов использования калибровочного графика

На цикле общего усовершенствования определить базовый уровень знания предмета, оценить умение курсанта находить наиболее верную тактику использования калибровочного графика в сложных ситуациях, которые могут создаться на рабочем месте.

На цикле ППС подробно разобрать требования к калибровочным материалам и правила их приготовления. Отработать на специальных примерах принципы построения калибровочного графика и способы расчета калибровочных растворов, и способы проверки правильности построения калибровочной кривой. В конце занятия проверить степень усвоения разобранной темы и подробнее остановиться на вызвавших затруднение вопросах.

При подготовке к занятию прочитать всю доступную литературу по данной теме, а в методическом кабинете проработать разработанное на кафедре учебное пособие. Самостоятельно используя стандартные наборы различных производителей рассчитать разными способами точки для построения калибровочной кривой, ответить на все контрольные вопросы которые приводятся в конце данного пособия. Если возникли какие-либо затруднения сформировать логически вопрос и задать его преподавателю на практическом занятии либо в начале, либо по ходу разбора темы.

Доис З., Количественные проблемы биохимии, М. 1983

Унификация лабораторных методов исследования. Стандартизация качества унифицированных клинических лабораторных методов исследования, М., 1981.

Лабораторное дело, 1977, №4, 253.

Камышников В.С. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике: В 2т. т.1 – Мн.: Беларусь, 2000. – 495 с.: ил.

В основе всех колориметрических методов положено светопропускание и светопоглащение. Приборы, используемые в фотометрическом анализе позволяют определить оптическую плотность и процент светопропускания. Но в отделение выдается результат исследования не в единицах оптической плотности, а в единицах концентрации. Экстинция исследуемого образца сравнивается с экстинцией образца компонента с точно известной концентрацией. Расчеты ведут по формуле или калибровочному графику.

Калибровочный график – это графическое изображение связи между измеряемой величиной экстинцией и концентрацией вещества.

Методы исследования, в основе которых лежит сравнение с образцом являются методами сравнения и их точность зависит от точности приготовления калибровочных растворов и чистоты веществ.

Характеристика калибровочных материалов

Для получения воспроизводимых, контролируемых, статистически достоверных и сравниваемых результатов существует система измерений, включающая методологию и соответствующие вещества контролируемого состава. Экспертная группа по номенклатуре качественного контроля предлагает разделить калибровочные стандарты на группы:

первичные – в которой масса стандартного вещества определяется взвешиванием;

вторичные – содержание компонентов определяется аналитическим методом.

Требования к первичному стандарту

Вещество должно быть стабильным.

Вещество должно иметь точно установленный состав.

Вещество должно иметь высокий эквивалентный вес, чтобы при взвешивании ошибка была минимальной.

Вещество не должно изменяться при очистке, сушке и т.д.

Этим требованиям в настоящее время соответствуют не все вещества, в основном неорганические.

В качестве калибровочных материалов могут использоваться вещества различной природы и степени чистоты, в зависимости от поставленных задач.

Правила при приготовлении калибровочных растворов

Используемое вещество должно быть максимально возможной чистоты с максимум содержания основного вещества – более 99,9 %. Чем чище вещество, тем оно стабильнее.

Например: есть вещества степени чистоты хч, чда, ч. Берем хч.

Навеска отвешивается с большой точностью на аналитических весах (в ряде случаев допустимо использование торсионных весов), но всегда в таре, с которой вещество можно смыть растворителем.

Навеска должна быть довольно большой, чтобы повысить точность взвешивания. Если по методике требуется слабый раствор, то готовят более концентрированный, а затем его разбавляют. Чем больше навеска – тем выше точность.

Иногда в методике есть специальные указания (например: высушить до постоянного веса и т.д.). Сушить можно прокаливанием, в термостате, в эксикаторе, выветриванием. Нужно посмотреть по химическому справочнику термоустойчивость вещества. Обязательно взвешивание до и после высушивания.

Нельзя готовить калибровочные растворы из гигроскопичных веществ.

Навеска тщательно смывается и растворяется в растворителе высокой чистоты. Вода должна быть свежеприготовленной, лучше (а для ряда методик только) бидистиллированной. При построении калибровочных кривых правильнее использовать не водные растворы, а стандартные сыворотки разного состава. Эти сыворотки самими не готовятся. Водные растворы хуже, так как при ряде исследований присутствующие в сыворотке белки оказывают определенное влияние – часть вещества может сорбироваться на белке и не участвовать в химической реакции — так называемый «матричный эффект». Например, в методике определения билирубина для калибровочного раствора берут сыворотку, так как билирубин в воде не растворяется, а растворенный в щелочи дает меньшую экстинцию.

Альбуминосодержащие калибровочные растворы следует применять в случаях, когда это указано в методике или если необходимо проверить влияние белка на надежность метода.

Диапазон стандартных растворов

Для любой исследуемой величины есть средняя величина, верхняя и нижняя граница норм, а при патологии может быть гипо- и гиперсодержание. Следовательно, в графике должны быть отражены все эти точки. Большое значение имеет чувствительность метода. Она определяется той наименьшей концентрацией вещества, которое еще может быть определено с достаточной точностью .

То есть концентрации веществ должны быть адоптированы к пределам нормы и чувствительности метода, и график обычно включает не менее 4-5 точек.

При проверке надежности метода, кроме того, следует определить:

-прямолинейность выше максимальной точки калибровочной кривой;

-прямолинейность между нулевой точкой и минимальной на калибровочной кривой. Для этого готовят еще по 3 точки (эквидистантные концентрации).

Для каждой выбранной точки готовят калибровочный раствор, который обрабатывают по методике в параллельных пробах (не менее 2-3), на график наносится среднее значение.

Общие требования

Разведение стандартного раствора готовят в арифметической, а не геометрической прогрессии, выдерживая 1 шаг: 0,1 мг, 0,2 мг, 0,3 мг и т.д.

При измерении оптических плоскостей следует учитывать оптическую плотность реактивов, иначе точка не пройдет через 0. Для этого колориметрируют против контроля, содержащего все реактивы.

Оптическую плотность, полученную для калибровочных растворов, наносим на систему координат. Лучше всего пользоваться миллиметровой бумагой достаточно большого размера. По оси ординат откладывается плотность, по оси абсцисс – концентрация. Масштаб выбирается произвольно: для концентраций – чтобы можно было считать с точностью, соответствующей практическим требованиям с учетом пределов нормы и чувствительности метода; для экстинции – учитывая цену деления прибора. Оптимально, когда наклон кривой к оси абсцисс проходит под углом 45 0 . При малом масштабе угол будет больше и кривая более крутая, при большем масштабе – кривая проходит более полого.

Если в пределах выбранных концентраций растворы соответствуют закону Ламберта-Бера, то график проходит через 0 точку и имеет вид прямой.

Всегда ли кривая в выбранном диапазоне концентраций проходит через точку 0? Нет, не всегда, даже если кривая правильная. Это может быть: 1. если реакция при больших и малых концентрациях протекает не строго стериохимически; 2. если исследование ведется не в монохромном свете. Надо перейти на другой прибор.

НО ВСЕГДА НАДО РАБОТАТЬ НА ЛИНЕЙНОМ УЧАСТКЕ КРИВОЙ.

Иногда это невозможно. Например, при определении белка по Лоури, где кривая очень быстро выходит на плато. В этом случае строят графическую калибровочную кривую. Кроме основных калибровочных растворов, проходящих по прямолинейному участку, берут не менее 10 стандартных растворов, проходящих по прямолинейному участку, берут не менее 10 стандартных растворов, соответствующих пологому участку. Т.е. на пологом участке будет много точек.

Приготовление калибровочных растворов

Из основного калибровочного вещества готовят ряд стандартных проб. Они могут быть приготовлены 2-мя способами, в зависимости от биохимии метода.

1 способ: Необходимая концентрация стандартного раствора обеспечивается за счет различных объемов одного и того же маточного (основного) стандартного раствора.