Уравнение михаэлиса ментен позволяет рассчитать

Уравнение Михаэлиса-Ментен. Ингибирование ферментов

Страницы работы

Содержание работы

УРАВНЕНИЕ МИХАЭЛИСА —МЕНТЕН

Простейшей моделью для построения и обсуждения теорий ферментативной кинетики является кинетика односубстратных реакций. Хотя чаще всего в реакциях участвует не один, а большее число субстратов, реакцию можно рассматривать как односубстратную, если второй субстрат присутствует в очень большой концентрации. Большинство получаемых выводов можно использовать непосредственно при рассмотрении более сложных ферментативных реакций.

Как уже упоминалось, концентрация субстрата является одним из наиболее важных факторов, определяющих скорость ферментативной реакции.

В начале XX столетия Л. Михаэлисом и М. Ментен было предложено простейшее кинетическое выражение для скорости ферментативной односубстратной реакции.

Схема ферментативного процесса записывается следующим образом:

где Е — фермент; S — субстрат, подвергающийся ферментативной реакции; Р — образующийся в результате продукт;

Уравнение скорости ферментативной реакции, выведенное Михаэлисом и Ментен, предположивших, что превращение субстрата происходит только в переходном фермент-субстратном комплексе, основывается на двух предпосылках.

1. Реакция между ферментом и субстратом находится в равновесии. Это условие выполняется, если скорость распада комплекса на свободный фермент и субстрат значительно больше скорости распада его до свободного фермента и продукта (k_-1 >> k₂).

2. Концентрация свободного субстрата остается практически постоянной в течение начального периода реакции, тогда концентрация субстрата [S] может быть принята равной полной концентрации субстрата [S_o]. Это условие выполняется, если полная концентрация субстрата значительно больше полной концентрации фермента, как это обычно имеет место при кинетических исследованиях.

При высокой каталитической активности фермента реальное значение концентрации фермент-субстратного комплекса отличается от его значения в условиях равновесия. Для анализа кинетики реакции с учетом этого обстоятельства Бриггс и Холдейн предложили дополнить теорию Михаэлиса — Ментен условием стационарного состояния.

Согласно этому условию в любой момент реакции скорости образования и распада комплекса ES практически равны, так что концентрация комплекса [ES] может считаться постоянной (квазистационарной) в течение короткого периода времени, необходимого для измерения скорости. В течение более продолжительного периода времени концентрация комплекса [ES] будет изменяться по ходу реакции в связи с падением концентрации субстрата, но скорость изменения ее всегда будет существенно меньше, чем скорость ферментативной реакции.

Для стационарного состояния, при котором

,

k₁[E][S] – (k_-1 + k₂)·[ES] = 0

(1)

Из уравнения материального баланса для фермента

где [E_o] ─ его начальная концентрация, а [E] ─ текущая концентрация свободного, не связанного в фермент-субстратный комплекс белка, можно записать

и подставить в выражение (1):

Отсюда концентрация ES равна

[ES] =

Тогда начальная скорость ферментативной реакции, измеряемая по скорости образования продукта Р, равна

(2)

(константа Михаэлиса),

то выражение (2) можно записать в следующем виде:

(3)

Выражение (3) называется уравнением Михаэлиса —Ментен и описывает зависимость скорости односубстратной ферментативной реакции от концентрации субстрата. Из этого уравнения видно, что при увеличении концентрации субстрата (при неизменной концентрации фермента) скорость реакции стремится к предельному значению, равному V_max.

При выводе уравнения Михаэлиса — Ментен, кроме вышеперечисленных, принимается во внимание еще несколько не совсем реальных допущений, таких как:

1) отсутствие образования значимого количества комплекса ЕР и других форм фермента;

2) необратимость второй стадии реакции, т. е. образования продукта Р. Это связано с тем, что мы рассматриваем только начальную скорость процесса, когда обратной реакцией из-за фактического отсутствия продукта еще можно пренебречь;

3) связывание с активным центром на каждой субъединице фермента только одной молекулы субстрата;

4) использование для всех реагирующих веществ вместо активностей их концентраций.

Если k₂ значительно меньше k_-1, то этим членом в выражении константы Михаэлиса можно пренебречь, и К_M становится равной отношению , а это есть К_d (константа диссоциации фермент-субстратного комплекса):

Таким образом, являясь аналогом константы диссоциации фермент-субстратного комплекса ES, константа Михаэлиса характеризует сродство фермента к субстрату. Чем ниже К_M, тем выше сродство.

На рис. 1 приведено графическое изображение уравнения Михаэлиса — Ментен.

Рис. 1.Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата

Методы определения Км и Vmax

Константу Михаэлиса можно определить из графика Михаэлиса (рис.2.2.1), найдя графическим способом максимальную скорость и соответствующую величину концентрации субстрата, при которой скорость ферментативной реакции будет вдвое меньше Vmax. Эта величина [S] и будет Км. Таким способом можно определить только приблизительную величину константы Михаэлиса из-за трудности точного графического определения Vmax.

Более удобными являются методы, в которых осуществлена линеаризация уравнения Михаэлиса-Ментен, т. е. гиперболическая зависимость v от [S] переведена в линейную.

Для того чтобы построить такой график, необходимо определить в одинаковых условиях при различных концентрациях субстрата и [E]= const начальные скорости ферментативной реакции.

Метод Лайнуивера-Берка. Один из способов линеаризации уравнения Михаэлиса-Ментен предложили Лайнуивер и Берк (Lineweaver H., Burk D.). Это так называемый метод двойных обратных величин. Для линеаризации необходимо взять обратные величины от левой и правой частей уравнения (3), в результате чего оно преобразуется в уравнение вида,

согласно которому между величинами, обратными начальной скорости (1/v, v -1 ) и концентрации субстрата (1/[S], [S] -1 ) соблюдается линейная зависимость, если механизм реакции подчиняется изложенным выше представлениям (рис.2.2.3).

Рис. 2.2.3. График зависимости 1/v от 1/[S] (график Лайнуивера-Берка)

Экспериментальная прямая пересекает ось абсцисс в точке (-1/[S] = 1/Км), а ось ординат – в точке (1/v = 1/Vмах). Тангенс угла наклона равен Км/Vмах. Этим широко пользуются для определения параметров Км и Vмах, характеризующих связывающую и каталитическую функции ферментов.

Метод Хайнса-Вульфа. В этом случае преобразуется уравнение Лайнуивера-Берка путем умножения правой и левой частей на концентрацию субстрата.

Графическая зависимость приведена на рис.2.2.4.

Рис. 2.2.4. График зависимости [S]/v от [S] (график Хайнса-Вульфа)

Это прямая с наклоном 1/Vmax, отсекающая на осях [S]/v и [S] отрезки Км/ Vmax и – Км соответственно.

Метод Иди-Хофсти. При одном из таких графических преобразований в так называемом графике Иди-Хофсти(pиc.2.2.5) строят график зависимости v от v/[S]. В этом случае точка пересечения прямой, полученной путем наилучшей линейной аппроксимации экспериментальных точек, с осью ординат соответствует Vmax, а тангенс угла наклона равен – K_m. Данный способ линеаризации приведен на рис. 2.2.5.

Рис. 2.2.5. График зависимости v от v/[S] (график Эди-Хофсти)

Метод Эйзенталя и Корниш-Боудена. Много позднее Эйзенталь и Корниш-Боуден предложили иной метод графического представления результатов исследования кинетики ферментативных реакций – так называемый прямой линейный график. Уравнение Михаэлиса-Ментен они преобразовали в виде зависимости Vmax от Км:

Для любой пары значений [S] и v можно построить зависимость Vmax от Км. Она представляет прямую с наклоном, равным v/[S], и отрезками, отсекаемыми на осях Км и Vmax, соответственно равными -[S] v. Если провести прямые для нескольких пар значений [S] и v, то эти прямые пересекутся в одной точке, координаты которой дадут единственные значения Vmax от Км, удовлетворяющие всем парам значений [S] и v (рис.2.2.6).

Преимущества такого графика очевидно: для его построения не требуется никаких расчетов, он позволяет очень просто выявить ошибочные данные (иакие прямые будут выпадать из основной совокупности прямых).

Уравнение Михаэлиса лежит в основе всех кинетических исследований ферментативных реакций, так как оно позволяет рассчитать количественные характеристики ферментов и проводить анализ их ингибирования. Величины К_m и V_max являются важнейшими характеристиками ферментов и их можно определить, используя линеаризованные формы уравнения Михаэлиса-Ментен.

В заключении необходимо отметить, что графические методы для определения V и К_m не являются оптимальными. В настоящее время данные ферментативной кинетики обрабатывают быстрее и более объективно с помощью компьютерных программ.

Процессы, приводящие к денатурации фермента, могут иметь различную физико-химическую природу. Конформация белковой молекулы в растворе зависит от двух показателей – величины рН и температуры. Повышение температуры приводит к нарушению системы слабых связей, стабилизирующих белковую молекулу. Длительное воздействие повышенной температуры приводит к необратимым изменениям структуры фермента, сопровождающимся потерей активности (тепловая денатурация).

Каждый фермент характеризуется соответствующим зарядом, создаваемым ионогенными группами аминокислотных остатков. При очень низких или высоких значениях рН изменение степени ионизации функциональных групп может приводить к необратимым нарушениям нативной конформации молекулы фермента с разрушением структуры активного центра.

Конформационные изменения в белковой молекулу сопровождаются изменениями спектров поглощения и флуоресценции ароматических аминокислот – тирозина и триптофана в ультрафиолетовой области спектра (

290 нм), что позволяет отслеживать изменения в структуре фермента. Обратимые конформационные, вызванные изменением температуры или концентрацией протонов водорода, осуществляются в течение 10 -4 – 10 -1 с, необратимые денатурационные изменения в зависимости от условий – в течение 1-10 3 мин. Более подробный анализ кинетики денатурации ферментов рассмотрен в Теме 5 учебного пособия по самостоятельной работе.

Уравнение михаэлиса ментен позволяет рассчитать

Кинетика ферментативных реакций

Кинетика ферментативной реакции (т. е. зависимость скорости реакции от ее условий) определяется в первую очередь свойствами катализатора , вследствие чего она значительно сложнее, чем кинетика некаталитических реакций (см. с. 28).

А. Модель Михаэлиса-Ментен

Полный математический анализ ферментативной реакции приводит к сложным уравнениям, не пригодным для практического применения. Наиболее удобной оказалась простая модель, разработанная в 1913 г. Она объясняет характерную гиперболическую зависимость активности фермента от концентрации субстрата ( 1 ) и позволяет получать константы, которые количественно характеризуют эффективность фермента.

Модель Михаэлиса-Ментен исходит из того, что вначале субстрат А образует с ферментом E ( З ) комплекс, который превращается в продукт В намного быстрее, чем в отсутствие фермента. Константа скорости k кат ( 2 ) намного выше, чем константа некаталитической реакции k. Константу k кат называют еще « числом оборотов » поскольку она соответствует числу молекул субстрата, превращаемых в продукт одной молекулой фермента за 1 с. Согласно этой модели, активность фермента определяется долей комплекса EA от общей концентрации фермента [E] t , т. е., отношением [EA] / [E] t ( З ). С целью упрощения модель предполагает, что E, А и ЕА находятся в химическом равновесии согласно закону действующих масс (см. с. 24), что дает в итоге для диссоциации комплекса EA уравнение:

[E][A]/[EA] = K m Поскольку [E] t = [E] + [EA],

Из v = k кат [EA] ( 2 ) и предыдущего выражения получают уравнение Михаэлиса-Ментен ( 4 ).

Уравнение содержит две величины ( два параметра ), которые не зависят от концентрации субстрата [A], но характеризуют свойства фермента: это произведение k кат [E] t , соответствующее максимальной скорости реакции V при высокий концентрации субстрата, и константа Михаэлиса К m , характеризующая сродство фермента к субстрату. Константа Михаэлиса численно равна той концентрации субстрата [A]. при которой ν достигает половины максимальной величины V (если v = V/2, то [A] / (К m + [A]) = 1/2, т. е. K m = [А]). Высокое сродство фермента к субстрату характеризуется низкой величиной К m и наоборот,

Модель Михаэлиса-Ментен основывается на нескольких не совсем реальных допущениях, таких, как необратимое превращение EA в E + В, достижение равновесия между E, A и EA, отсутствие в растворе других форм фермента, кроме E и EA. Только при соблюдении этих гипотетических условий K m соответствует константе диссоциации комплекса, а k кат — константе скорости peакции EA → E + В.

Б. Определение V и К m

В принципе V и К m можно определить по графику зависимости v от [A] (рис. слева). Так как v асимптотически достигает V с возрастанием концентрации субстрата [A], то затруднительно получить надежную величину V и К m (рис. слева) путем экстраполяции.

Для удобства расчетов уравнение Михаэлиса-Ментен можно преобразовать так, чтобы экспериментальные точки лежали на прямой. При одном из таких графических преобразований в так называемом графике Иди-Хофсти (pиc. справа) строят график зависимости v от v/[A]. В этом случае точка пересечения прямой, полученной путем наилучшей линейной аппроксимации экспериментальных точек, с осью ординат соответствует V, а тангенс угла наклона равен -K m . Такой графический подход дня определения V и К m также не оптимален. В настоящее время данные ферментативной кинетики обрабатывают быстрее и более объективно с помощью вычислительной техники.