Реферат: Люминесцентный анализ методические рекомендации
Название: Люминесцентный анализ методические рекомендации Раздел: Остальные рефераты Тип: реферат Добавлен 19:31:18 16 августа 2011 Похожие работы Просмотров: 5806 Комментариев: 17 Оценило: 2 человек Средний балл: 5 Оценка: неизвестно Скачать
ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ
Бийский технологический институт (филиал)
государственного образовательного учреждения
высшего профессионального образования
«Алтайский государственный технический университет
им. И.И. Ползунова»
Н.В. Степанова, Т.В. Сеношенко,
Н.А. Крамаренко, З.В. Татарникова
Методические рекомендации по выполнению лабораторных работ
по курсу «Аналитическая химия и физико-химические методы
анализа» для студентов специальностей 240701, 240702, 240901, 260204 и для специальности 080401 по курсу «Физико-химические
методы анализа» всех форм обучения
Издательство Алтайского государственного технического университета
им. И.И. Ползунова
Рецензент: к.т.н. К.С. Барабошкин ФНПЦ «Алтай»
Люминесцентный анализ: методические рекомендации по выполнению лабораторных работ по курсу «Аналитическая химия и физико-химические методы анализа» для студентов специальностей 240701, 240702, 240901, 260204 и для специальности 080401 по курсу «Физико-химические методы анализа» всех форм обучения / Н.В. Степанова, Т.В. Сеношенко, Н.А. Крамаренко, З.В. Татарникова; Алт. гос. техн. ун-т, БТИ. – Бийск: Изд-во Алт. гос. техн. ун-та, 2010. – 20 с.
Методические рекомендации составлены для студентов специальностей «Химическая технология органических соединений азота» (240701), «Химическая технология полимерных композиций, порохов и твердых ракетных топлив (240702), «Биотехнология» (240901), «Технология бродильных производств и виноделие» (260204), «Товароведение и экспертиза товаров» (080401) в соответствии с требованиями Государственных образовательных стандартов высшего профессионального образования (Москва, 2000 г.).
Настоящие методические рекомендации содержат основные сведения о люминесцентном методе анализа различных веществ.
Приводятся краткие теоретические положения люминесцентного метода анализа и рекомендации к выполнению двух лабораторных работ с помощью флуориметрического метода анализа.
Методические рекомендации содержат вопросы и задачи для контроля знаний студентов по рассматриваемой теме.
1.1 Теоретические основы люминесцентного анализа……………4
1.2 Методы определения содержания веществ
в люминесцентном анализе………………………………………………..7
1.4 Аппаратура для люминесцентного анализа…………………..11
2 Экспериментальная часть……………………………………………. 12
2.1 Определение содержания рибофлавина (витамин В2 ) ………12
2.2 Флуориметрическое определение содержания
3 Общие указания к лабораторным работам……………………………17
4 Контрольные вопросы для допуска к выполнению
5 Вопросы для защиты работ…………………………………………….18
1 ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
1.1 Теоретические основы люминесцентного анализа
Способность атомов и молекул поглощать энергию, поступающую к ним извне, вызывает новое энергетическое состояние вещества, которое называется возбужденным. Избыточная энергия атомов или молекул, полученная при возбуждении, может быть израсходована на отрыв электронов — ионизацию вещества; на какие-либо фотохимические реакции; на нагрев вещества, т. е. переход избыточной энергии в тепловую. Кроме того, возбужденные атомы или молекулы способны отдавать всю избыточную энергию или часть ее в виде света. Как правило, большинство твердых веществ при сильном нагревании светятся. Такое свечение раскаленных тел называют температурным или тепловым излучением. Чем больше энергии при данной температуре поглощает тело, тем оно больше ее излучает.
У некоторых веществ наблюдается свечение и без нагревания при комнатной температуре, которое называют холодным свечением или люминесценцией. В отличие от температурного люминесцентное излучение является неравновесным и продолжается относительно долгое время после прекращения действия внешнего возбуждающего фактора.
Таким образом, люминесценция – свечение вещества после поглощения им энергии возбуждения:
Переходя в более низкое энергетическое состояние, возбужденные частицы испускают квант света – люминесцируют . Длительность послесвечения для различных люминесцирующих веществ различна: от миллиардных долей секунды (для отдельных атомов и молекул) до часов и даже нескольких суток (для кристаллофосфоров).
Явления люминесценции многообразны по свойствам и происхождению. Различные виды люминесценции определяются характером энергии возбуждения, продолжительностью свечения и химическими свойствами люминесцирующих веществ. В зависимости от вида люминесценции рассматривают следующие разделы люминесцентного анализа: 1) фотолюминесценция, или флуоресценция, основанная на свечении вещества при поглощении лучистой, или световой энергии;
2) катодолюминесценция, вызванная бомбардировкой быстролетящих электронов; 3) хемилюминесценция — свечение веществ под действием
некоторых химических процессов; 4) триболюминесценция — люминесценция трения и т. п.
Все люминесцирующие вещества имеют общее название люминофоры.
Неорганические люминофоры называют чаще всего просто люминофорами, а органические — органолюминофорами. Органические и неорганические люминофоры существенно отличаются по природе свечения. У первых процессы поглощения возбуждающего света и излучения протекают в пределах каждой способной люминесцировать молекулы. У вторых, чаще всего активированных и имеющих кристаллическую структуру, в акте люминесценции участвуют не отдельные атомы и молекулы, а кристаллы. Эти люминофоры называют кристаллофосфорами.
Известно два механизма возникновения свечения: 1) свечение отдельных центров, когда процесс возникновения люминесценции протекает лишь в одной частице (центр свечения), являющейся как поглотителем энергии, так и излучателем световых квантов, и 2) рекомбинационные процессы свечения, при которых, как правило, поглощение энергии осуществляется не теми частицами, которые излучают световые кванты.
По первому механизму осуществляется свечение большинства органических веществ в растворе, в том числе и внутрикомплексных соединений органических люминесцентных реагентов с катионами. Свечение кристаллов с решетками молекулярного типа, например, нафталина, антрацена и их производных, определяется рекомбинационными процессами. Такое свечение наблюдается и у сульфида цинка, сульфида кадмия, оксида кальция и т. п., кристаллические решетки которых обладают некоторыми дефектами, вызванными внедрением примесей (или активаторов) — ионов тяжелых металлов. В этом случае в возникновении флуоресценции принимает участие весь кристалл в целом, такой вид свечения называют свечением кристаллофосфоров.
В качественном люминесцентном анализе по цвету свечения и особенно по спектрам люминесценции можно установить присутствие того или иного вещества в пробе. При сопоставлении спектров люминесценции пробы и индивидуальных веществ, которые могут входить в состав пробы, основное внимание обращают на положение максимумов и ширину полос, наличие и характер их тонкой структуры. Установить присутствие вещества в пробе по цвету ее свечения или спектру люминесценции — задача непростая. Сложность этой задачи обусловлена тем, что многие вещества обладают одинаковым (с точки зрения восприятия человеческим глазом) свечением, а спектры их люминесценции состоят из широких, размытых полос.
В этом случае нельзя рассчитывать на успешную идентификацию веществ. Лишь немногие вещества обладают достаточно четкими и характерными спектрами люминесценции, позволяющими надежно установить их присутствие в пробе. К ним относятся соединения урана (VI), лантаноидов, бензопирены, порфирины и др.
При наличии в пробе нескольких люминофоров обычно проводят процедуру их разделения, используя чаще всего методы экстракции и хроматографии. Селективно возбуждая спектры люминесценции отдельных компонентов, в некоторых случаях удается провести качественный анализ многокомпонентных проб, минуя процедуру предварительного разделения компонентов.
На основании изучения спектров люминесценции можно сделать некоторые выводы относительно химической структуры исследуемого вещества, а также проследить за изменением, претерпеваемым веществом во времени. Для обнаружения веществ, не обладающих собственной люминесценцией, используют реакции, приводящие к образованию люминофоров, — так называемые люминесцентные реакции. Иногда наличие искомого вещества в пробе удается установить по частичному или полному тушению люминесценции вспомогательного люминофора, введенного в пробу.
Количественный люминесцентный анализ базируется на зависимости между интенсивностью люминесценции If (отн. ед.) и содержанием люминофора в пробе (с):
где If — интенсивность люминесценции;
с — молярная концентрация, моль/л;
k – коэффициент, зависящий от природы вещества.
Эта зависимость соблюдается лишь в том случае, если содержание определяемого компонента в пробе не превышает некоторого порогового значения:
10 -4 …10 -3 М (для жидких проб);
10 -4 …10 -3 % (для твердых проб).
Проведение количественного люминесцентного анализа осложняется тем, что интенсивность люминесценции зависит не только от содержания определяемого вещества в пробе, но и от ряда других факторов: тушения люминесценции, значения рН среды, массовой доли комплексонов и др. В связи с этим, следует строго соблюдать все рекомендации, касающиеся подготовки проб, а также условия возбуждения и регистрации спектров люминесценции.
Чаще всего для возбуждения люминесценции используют источники ультрафиолетового (УФ) излучения. Если же люминофор обладает интенсивным поглощением в видимой области спектра, то для возбуждения его люминесценции можно использовать лампу накаливания. В настоящее время для возбуждения люминесценции все чаще используют лазерное излучение.
Люминесцентный метод анализа, так же как и фотометрический метод, относятся к группе оптических методов анализа, и потому они имеют много общего. Однако по сравнению с фотометрией люминесцентный метод имеет существенные преимущества. Прежде всего, чувствительность люминесцентного метода гораздо выше чувствительности фотометрического метода. Это связано с тем, что в люминесцентном методе определяют абсолютную величину светового потока, испускаемого возбужденной молекулой, и, таким образом, отношение полезного сигнала к шуму очень велико. В противоположность фотометрическому методу (где измеряется величина отношения двух световых потоков) в люминесцентном методе величина фототока, пропорциональная свету люминесценции, может быть многократно усилена электронным усилителем. Последнее обстоятельство позволяет определять количества вещества, на один-два порядка меньшие, чем в фотометрическом методе анализа.
Второе преимущество заключается в относительно высокой селективности люминесцентного метода анализа, поскольку сравнительно небольшое число веществ способно люминесцировать.
1.2 Методы определения содержания веществ
в люминесцентном анализе
Определение содержания вещества в пробе люминесцентным методом основано на сравнении интенсивности люминесценции пробы и стандартных образцов. Последние должны отвечать ряду требований:
— содержание определяемого вещества в стандартном образце должно быть точно известно;
— химический состав матрицы (основы) стандартного образца должен быть идентичен (или подобен в практически достижимой мере) матрице пробы;
— стандартный образец и проба должны обладать близкими физическими свойствами.
В практике люминесцентного анализа используют как жидкие, так и твердые стандартные образцы. Жидкие стандартные образцы готовят растворением определяемого вещества в подходящем растворителе. При этом в раствор добавляют в необходимых количествах вещества, составляющие основу пробы. Применение люминесценции кристаллофосфоров для определения неорганических веществ связано с использованием твердых стандартных образцов. Как правило, процедура их приготовления трудоемка, требует тщательности и особых мер предосторожности и обычно проводится на специальной аппаратуре.
Для расчета содержания вещества в пробе по результатам люминесцентных измерений чаще всего используют метод градуировочного графика, сравнения и добавок.
Метод градуировочного графика . В этом методе измеряют интенсивность люминесценции серии стандартных образцов (обычно не менее пяти), охватывающих весь диапазон ожидаемых содержаний определяемого вещества в пробе, и строят график зависимости интенсивности люминесценции от массовой доли определяемого вещества. В идеальном случае градуировочный график должен быть линейным и проходить через начало координат. На практике он оказывается линейным лишь в узком диапазоне содержаний определяемого вещества и редко выходит из начала координат.
Метод добавок. Наиболее простой способ приготовления стандартных образцов, соответствующих пробе по составу матрицы, заключается в использовании метода добавок. Его целесообразно использовать в тех случаях, когда состав матрицы пробы неизвестен или меняется от пробы к пробе.
Сущность метода заключается в следующем. Берут три одинаковых образца пробы. Ко второму и третьему образцам добавляют точное количество определяемого вещества. Размеры добавок подбираются с таким расчетом, чтобы содержание определяемого вещества во всех трех образцах пробы после указанной процедуры отвечало соотношению
где Dc1 и Dс2 — изменение содержания определяемого вещества, вызванное процедурой добавки.
После измерения интенсивности люминесценции всех трех образцов строят график в координатах «I -Dc». Содержание определяемого вещества в пробе сх находят путем экстраполяции графика на значение I =0.
В аналитической практике наиболее широкое применение получила фотолюминесценция, а именно флуоресценция. Флуоресценция — это характерное свечение анализируемых растворов и кристаллофоров в ультрафиолетовом свете.
Флуориметрия — метод определения содержания люминофора в растворе, основанный на измерении спектра его флуоресценции. В основе этого метода лежат следующие закономерности.
Независимость спектра люминесценции от длины волны возбуждающего света . Это объясняется тем, что возбужденные молекулы, поглотившие кванты различной величины, попадают на уровни разных возбужденных электронно-колебательных состояний. После такого перераспределения избыточной энергии происходит излучательный переход с одних и тех же электронных уровней, поэтому спектр люминесценции не изменяется.
Закон Стокса–Ломмеля. Стоксом было сформулировано правило, согласно которому спектр флуоресценции вещества всегда имеет большую длину волны, чем спектр поглощения. Ломмель уточнил правило Стокса, предложив для него следующую формулировку: «Спектр излучения в целом и его максимум всегда сдвинуты по сравнению со спектром поглощения и его максимумом в сторону длинных волн». Закон Стокса-Ломмеля строго выполняется для широкого круга флуоресцирующих веществ.
Правило зеркальной симметрии спектров поглощения и излучения. Это правило характеризует взаимное расположение спектров поглощения и излучения веществ, обладающих люминесценцией, и может быть сформулировано следующим образом: «Нормированные (приведенные к одному максимуму) спектры поглощения и излучения, изображенные в функции частот, зеркально симметричны относительно прямой, проходящей перпендикулярно к оси частот через точку пересечения обоих спектров» (рисунок 1). Это правило весьма полезно при выполнении люминесцентного анализа, а также при расшифровке спектров и установлении энергетических уровней исследуемых молекул.
У веществ, подчиняющихся правилу зеркальной симметрии, можно по одному из спектров (поглощения или люминесценции) без их измерений установить форму другого спектра и выбрать подходящие для данного вида анализа светофильтры.
Рисунок 1 — Зеркальная симметрия спектров поглощения ε = f (v )
(кривая 1) и флуоресценции I /v = f (v ) (кривая 2) родамина 6Ж в ацетоне
Вещества-люминофоры определяют по их собственной флуоресценции. Если определяемые вещества не являются люминофорами, то для их определения используют люминесцентные реакции. Последние должны сопровождаться возникновением или ослаблением флуоресценции раствора. Как и каждая реакция, применяемая в анализе, люминесцентная реакция должна протекать быстро, количественно, быть воспроизводимой и по возможности избирательной. При флуориметрическом определении ионов металлов чаще всего используют реакции комплексообразования с органическими реагентами. В идеальном случае применяемые для анализа реагенты не должны флуоресцировать, а образующиеся комплексы, напротив, должны обладать интенсивной флуоресценцией. Молекулы таких реагентов обычно имеют неплоскую и нежесткую ароматическую структуру и содержат электронодонорные заместители. В результате комплексообразования они приобретают плоскую жесткую конфигурацию, склонную к флуоресценции.
Для определения анионов часто используют косвенный флуориметрический метод, основанный на тушении люминесценции. Примером такого метода может служить определение иодид-ионов по тушению флуоресценции флуоресцеина.
На чувствительность флуориметрических определений существенное влияние оказывает присутствие посторонних веществ. Посторонние вещества могут снижать выход люминесценции либо уменьшать интенсивность свечения люминофора за счет эффекта внутреннего фильтра, понижая тем самым чувствительность определений. Для достижения максимальной чувствительности определения из двух реагентов выбирают тот, который приводит к образованию люминофора, характеризующегося минимальным перекрыванием спектров поглощения и излучения.
Пределы обнаружения веществ флуориметрическим методом составляют от 10 -8 до 10 -4 %.
1.4 Аппаратура для люминесцентного анализа
При проведении люминесцентного анализа необходимо измерять всевозможные спектрально-люминесцентные характеристики люминофора: интенсивность люминесценции, спектр возбуждения, спектры люминесценции и др. С этой целью используют различные люминесцентные приборы. Каждый такой прибор включает в себя шесть основных узлов:
– источник возбуждающего света;
– селектор частоты возбуждающего света и частоты люминесценции;
– кюветное отделение, предназначенное для размещения кюветы с измеряемым образцом (стандартным образцом или пробой);
Приборы, предназначенные для измерения флуоресценции, можно разделить на три категории: – флуориметры, флуоресцентные приставки к спектрофотометрам и спектрофлуориметры. Схема простейшего флуориметра приведена на рисунке 2.
Во флуориметрах селекция частот возбуждающего света и света флуоресценции осуществляется с помощью светофильтров. Флуориметры применяют для проведения серийных анализов, где снижение селективности не является большим недостатком, а высокая чувствительность, напротив, представляет собой важное достоинство.
1 − источник УФ излучения; 2 − первичный светофильтр;
При измерении флуоресценции с помощью флуориметров существенное значение имеет правильный выбор светофильтров, необходимых для разделения света, возбуждающего флуоресценцию (первичный светофильтр), и света флуоресценции (вторичный светофильтр). Первичный светофильтр должен пропускать свет в области поглощения определяемого вещества и не должен пропускать свет в области, отвечающей флуоресценции вещества. Вторичный светофильтр должен пропускать флуоресценцию, но возбуждающий свет должен им полностью поглощаться. Источниками возбуждающего света во флуориметрах обычно служат ртутные лампы низкого давления. С целью получения практически сплошного спектра излучения внутренние стенки этих ламп часто покрывают люминофором.
2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1 Определение содержания рибофлавина (витамина В2 )
Цель работы: освоение методов количественного люминесцентного анализа, приобретение навыков работы на флуориметре «Квант», определение витамина В2 методом прямой флуориметрии.
2.1.1 Краткая характеристика метода
Метод основан на сравнение интенсивности флуоресценции стандартного и анализируемого растворов витамина В1 при облучении светом ультрафиолетового диапазона. Содержание витамина В1 определяют, не прибегая к построению градуировочного графика лишь по одной точке, стандартный раствор при этом готовят с содержанием рибофлавина, близким к определяемому содержанию и не превышающим 1 . 10 -5 моль/дм 3 .
2.1.2 Необходимые реактивы
1. Рабочий стандартный раствор.
2. Анализируемый раствор.
Для приготовления рабочего стандартного раствора , содержащего 0,04 мг/см 3 рибофлавина, взвешивают 0,0400 г рибофлавина в стаканчике или в фарфоровой чашке (навеску пересчитывают на чистую субстанцию). Затем навеску растворяют в горячей воде и переносят в мерную колбу объемом 1 дм 3 на водяной бане. После охлаждения объем доводят до метки дистиллированной водой. Раствор годен в течение 1 месяца при условии его хранения в бутылке из темного стекла в холодильнике при температуре от 5 до 10 0 С. В день проведения испытаний часть основного раствора переносят в стаканчик и выдерживают в темном месте до приобретения комнатной температуры, затем отбирают пипеткой 10 см 3 раствора в мерную колбу объемом 100 см 3 и доводят объем раствора до метки (1 см 3 раствора содержит 0,0004 мг/см 3 рибофлавина). Раствор годен только в день приготовления, а между измерениями хранится в темном месте.
В качестве анализируемого раствора используют или готовый раствор рибофлавина, или его готовят следующим образом: навеску растертых в ступке драже массой около 1 г взвешивают с точностью до 0,0002 г, растворяют в горячей дистиллированной воде при подогревании на водяной бане и количественно переносят в мерную колбу объемом 500 см 3 . Затем раствор охлаждают, доводят объем до метки и фильтруют через обычную фильтровальную бумагу (первые 10 см 3 отбрасывают). Из полученного раствора готовят раствор второго разведения. Для этого отбирают 10 см 3 раствора в мерную колбу на 100 см 3 и доводят до метки дистиллированной водой. Расчетное содержание рибофлавина в растворе около 0,4 мкг/см 3 или 0,0004 мг/см 3 . Между замерами раствор хранится в темном месте.
2.1.3 Выполнение работы на приборе «Квант»
Определение содержания рибофлавина проводят на приборе «Квант», внешний вид которого представлен на рисунке 3.
светофильтр; 11 — кюветное отделение; 12 — установка нуля;
13 — установка чувствительности; 14 — миллиамперметр
Рисунок 3 — Внешний вид флуориметра «Квант»
Для проведения измерений на флуориметре «Квант» необходимо соблюдать следующий порядок.
1. Включить прибор в сеть переменного тока с напряжением 220 В и нажать кнопку 1 «сеть», при этом загорается индикаторная лампочка.
2. Дать прибору прогреться не менее 60 мин.
3. По спектрам поглощения и флуоресценции (экспериментальные или литературные данные) выбрать необходимые первичный и вторичный светофильтры. При установке светофильтра необходимо следить, чтобы зеркальная поверхность первичного светофильтра была обращена к источнику света, а вторичного — к кювете.
При определении рибофлавина первый светофильтр синий (длина волны 440 нм), а второй светофильтр – зеленый (длина волны 520 нм).
4. Установить электрический нуль прибора, проделав следующие операции:
– перевести в левое положение ручку «0 %» до упора;
– вращением ручки «установка нуля» установить стрелку индикатора миллиамперметра на нуль.
5. Определить фон «холостого опыта» или растворителя и провести его компенсацию:
– установить в прибор кювету с растворителем («холостая проба»);
– нажать кнопку «Измерение» и вращением ручки отсчетного лимба установить стрелку индикатора на нуль (показания лимба будут соответствовать величине фона растворителя («холостого опыта»));
– установить на нуль шкалу отсчетного лимба «%», нажать кнопку «Измерение» и вращением ручки «установка 0 %» вывести стрелку индикатора на нуль. Фон растворителя будет скомпенсирован, и при дальнейших измерениях его можно не учитывать.
Внимание! При определении содержания рибофлавина «холостой пробой» является дистиллированная вода.
6. Заполнить кювету стандартным раствором. Нажать кнопку «Чувствительность» и вращением ручки «Установка чувствительности» добиться отклонения стрелки индикатора до деления 20 слева от 0. При этом надо следить, чтобы был выставлен 0 % на отсчетном лимбе и ручка «0 %» находилась в левом положении.
7. Не вынимая кювету с эталонным раствором, установить шкалу отсчетного лимба на деление 50 %. Нажать кнопку 1 переключателя «грубо», кнопку «Измерение» и вращением ручки «установка 100 % точно» установить стрелку индикатора на нуль. Если стрелка на нуль не устанавливается, включить кнопку 2 или 3 на переключателе «грубо», а затем нажать кнопку «Измерение» и ручкой «установка 100 % точно» добиться установки стрелки индикатора на нуль.
8. Определить интенсивность флуоресценции анализируемого раствора:
– установить в прибор кювету с анализируемым раствором;
– нажать на клавишу «Измерение» и вращением отсчетного лимба установить стрелку индикатора на нуль. Показания лимба будут соответствовать интенсивности светового потока флуоресценции исследуемого раствора в процентах.
2.1.4 Обработка результатов анализа
Содержание рибофлавина в одном драже (С) в граммах вычисляют по формуле
С =, г (2. 1)
где А — показания флуориметра при замере испытуемого раствора;
В – показания флуориметра при замере стандартного образца;
А1 и В1 — показания флуориметра после гашения флуоресценции гидросульфитом натрия в растворах ( из опытных данных равно 1).
V1 – объем испытуемого раствора, взятый для разведения (10 см 3 );
V2 – окончательный объем разведения (100 см 3 );
500 – первичный объем раствора, см 3 ;
а – масса навески, взятая для испытания, г;
б – средняя масса одного драже, г;
1000 – коэффициент пересчета в граммы.
Содержание рибофлавина в готовом растворе (С , мг/см 3 ) вычисляют по формуле
С =, (2. 2)
где Сст – содержание рибофлавина в стандартном растворе, мг/см 3 .
2.2 Флуориметрическое определение содержания
родамина 6Ж (6 часов)
Цель работы: определить содержание родамина 6Ж в исследуемом растворе с помощью метода калибровочного графика.
2.2.1 Краткая характеристика метода
Родаминовые красители (родамины) относятся к группе полярных ксантеновых красителей. Они обладают яркой флуоресценцией в жидких растворах (вода, спирт), что объясняется наличием у родаминов кислородных мостиков, придающих их молекулам необходимую «жесткость», а следовательно, и способность к флуоресценции. Родамины интенсивно поглощают в видимой и менее интенсивно в ультрафиолетовой части спектра. Поэтому для возбуждения их флуоресценции можно применять как видимый, так и ультрафиолетовый свет.
Эти соединения характеризуются молекулярным типом свечения, спектры поглощения и флуоресценции зеркально симметричны.
Согласно правилу зеркальной симметрии (см. рисунок 2) флюоресценцию родамина 6Ж необходимо измерять при длине волны возбуждения 520 нм и длине волны флюоресценции 580 нм.
В зависимости от концентрации исследуемого раствора готовят одну из серий эталонных растворов родамина 6Ж:
первая серия (мкг): 1,0; 2,0; 4,0; 6,0; 8,0;
вторая серия (мкг): 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0.
Для этого в ряд мерных колб вместимостью 25 см 3 вводят соответствующие объемы стандартных растворов родамина 6Ж (1,0 , 10 -6 или 1,0 , 10 -7 г/см 3 ) и разбавляют дистиллированной водой до метки.
В кювету флуориметра «Квант» наливают 10 см 3 стандартного раствора родамина 6Ж и измеряют флуоресценцию. Затем стандартный раствор выливают, кювету ополаскивают несколько раз дистиллированной водой и 2–3 раза анализируемым раствором, заполняют кювету анализируемым раствором и измеряют флюоресценцию. Измерение интенсивности флуоресценции проводится по отношению к воде.
По полученным данным строят градуировочный график, откладывая по оси абсцисс содержание С родамина (мкг), по оси ординат – интенсивность флуоресценции If .
Исследуемый раствор (контрольная задача) разбавляют водой до метки в мерной колбе вместимостью 25 см 3 , перемешивают и измеряют интенсивность флуоресценции. Содержание родамина в исследуемом растворе определяют по градуировочному графику.
3 ОБЩИЕ УКАЗАНИЯ К ЛАБОРАТОРНЫМ РАБОТАМ
При выполнении лабораторных работ необходимо следовать перечисленным ниже рекомендациям.
1. Прочитать все разделы методического указания, касающиеся выполняемой работы.
2. Познакомиться с описанием приборов и порядком работы на них. Включать приборы следует непосредственно перед проведением измерений.
3. Стандартные и анализируемые растворы следует готовить одновременно в строгом соответствии с методикой, а посуда для их приготовления и кюветы должны быть тщательно вымыты.
4. Кюветы перед заполнением необходимо два раза ополоснуть небольшим количеством измеряемого (стандартного или анализируемого) раствора и перед установкой в кюветное отделение тщательно осушить фильтровальной бумагой их внешние стенки. Заполняют кювету измеряемым раствором до такого уровня, чтобы поток возбуждающего света проходил полностью через слой раствора.
5. Чтобы не загрязнять рабочие поверхности светофильтров и кювет, их следует брать только за кромки или углы. Загрязненные светофильтры аккуратно протирают чистой фланелью, а кюветы — фильтровальной бумагой.
6. По окончании работы необходимо отключить все приборы, вымыть кюветы дистиллированной водой и сдать их лаборанту. Привести рабочее место в порядок.
7. Записи в лабораторном журнале рекомендуется делать в следующем порядке: а) название выполняемой лабораторной работы;
б) формулы люминесцирующих соединений и краткая методика их анализа; в) условия проведения измерений; г) результаты измерений в виде таблиц и графиков; д) обработка результатов измерений и оценка определяемых величин.
4 КОНТОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ ДЛЯ ДОПУСКА
К ВЫПОЛНЕНИЮ ЛАБОРАТОРНЫХ РАБОТ
1. Устройство прибора «Квант» и принцип его работы.
2. Методика проведения лабораторной работы.
3. Порядок приготовления стандартных и анализируемых растворов, используемых в работе.
4.Техника безопасности при проведении лабораторной работы.
5. Порядок представления результатов анализа.
5 ВОПРОСЫ ДЛЯ ЗАЩИТЫ РАБОТ
1. Какова природа люминесцентного излучения?
2. Каким образом классифицируют методы люминесцентного анализа?
3. На чем основан качественный люминесцентный анализ?
4. От чего зависит интенсивность люминесценции? Как она связана с концентрацией?
5. Каковы достоинства и недостатки люминесцентного анализа?
6. Какие методы используют для определения концентрации вещества в люминесцентном методе анализа?
7. На чем основан флуориметрический метод анализа?
8. Какие вещества можно анализировать с помощью флуориметрического метода анализа?
9. С чем связана необходимость применения в флуориметрии двух светофильтров?
10. Почему для измерения флуориметрии используют только разбавленные растворы с концентрацией не более 10 -3 …10 -4 моль/дм 3 .
11. На чем основан закон Стокса–Ломмеля?
12. Для чего используется правило зеркальной симметрии спектров поглощения и излучения?
13. Приведите схему простейшего флуориметра.
14. На чем основан метод определения содержания витамина В2 ?
15. На чем основан метод определения содержания родамина 6Ж?
1. Крешков, А.П. Основы аналитической химии / А.П. Крешков. — М.: Химия, 1976. — Т.2. — 480 с.
2. Алексеев, В.Н. Количественный анализ / В.Н. Алексеев. — М.: Химия, 1972. — 504 с.
3. Пономарев, В.Д. Аналитическая химия / В.Д. Пономарев. — М.: Высшая школа, 1982. — 304 с.
4. Скуг, Д.А. Основы аналитической химии / Д.А. Скуг, Д.М. Уэст. — М.: Мир, 1979. — 480 с.
6. Основы аналитической химии / под ред. Ю.А. Золотова. — Кн. 1-2. — М.: Химия, 1999.
7. Лебухов, В.И. Физико-химические свойства и методы потребительских товаров / В.И. Лебухов, А.И. Окара, Л.П. Павлюченкова. – Хабаровск: Хабаровская ГАЭиП, 1999. – 252 с.
8. Аналитическая химия. Кн. 2. Физико-химические методы анализа. – М.: Дрофа, 2001. – 340 с.
9. Васильев, В.П. Теоретические основы физико-химических методов анализа / В.П. Васильев. – М.: Высш. шк., 1979. – 184 с.
10. Практическое руководство по физико-химическим методам анализа / под редакцией И.П. Алимарина, В.М. Иванова. – М.: Изд-во Моск. ун-та, 1987. – 208 с.
Степанова Наталья Владимировна
Сеношенко Тамара Владимировна
Крамаренко Нина Алексеевна
Татарникова Зоя Васильевна
Методические рекомендации по выполнению лабораторных работ
по курсу «Аналитическая химия и физико-химические методы
анализа» для студентов специальностей 240701, 240702, 240901, 260204 и для специальности 080401 по курсу «Физико-химические
методы анализа» всех форм обучения
Редактор Идт Л.И.
Технический редактор Сазонова В.П.
Подписано в печать 19.02.2010. Формат 60´84 1/16
Усл. п. л. — 1,16. Уч.-изд. л. — 1,25
Печать — ризография, множительно-копировальный
Люминесцентный анализ (определение, параметр количественного анализа). Квантовый выход люминесценции (определение, формула)
Под люминесцентным анализом понимают совокупность методов анализа, основанных на явлении люминесценции. В люминесцентном анализе используют все виды возбуждения, но чаще всего — фотовозбуждение. Люминесцентный анализ подразделяют на качественный и количественный. Качественный анализ проводят по спектрам люминесценции, по их виду можно судить о присутствии того или иного вещества в пробе (анализируемом образце). Количественный люминесцентный анализ основан на измерении интенсивности люминесценции определяемого вещества. Его производят по интенсивности линий в спектре люминесценции.
Квантовый выход люминесценции jL равен отношению числа испускаемых фотонов к числу поглощаемых. где:
— число излучённых квантов,
— число поглощённых квантов.
10.Хемилюминесценция — люминесценция (свечение) тел, вызванная химическим воздействием (например, свечение фосфора при медленном окислении), или при протекании химической реакции (например, каталитические реакции некоторых эфиров щавелевой кислоты с пероксидом водорода в присутствии люминофора). Хемилюминесценция связана с экзотермическими химическими процессами. Хемилюминесценция, протекающая в живых организмах (свечение насекомых, червей, рыб), называется биолюминесценцией и связана с окислительными процессами.Хемилюминесценция (ХЛ) — это свечение,сопровождающее химическую реакцию.A + B = P* -Образование продукта в электроном возбужденном состоянии (хемилюминесцентная реакция).
P* P + фотон -Испускание кванта света
Виды хемилюминесценции в живых системах
1. Биолюминесценция (БЛ).( это видимое глазом(т.е. весьма интенсивное) свечение некоторых организмов, связанное со специфическими ферментативными реакциями.)2. Митогенетические лучи (МЛ).3. Сверхслабое свечение (Собственная хемилюминесценция — СХЛ) клеток и тканей.4. Активированная хемилюминесценция (АХЛ).5. Индуцированная ХЛ:
Что дает изучение ХЛ для медицины?
1. Изучение механизма реакций,сопровождающихся свечением (ХЛ-реакции).
• Изучение первичных стадий фотобиологических процессов.
• Изучение цепного окисления липидов.
• Изучение «активных форм кислорода».
• Изучение механизма действия
2. Применение ХЛ в лабораторной клинической
• Оценка уровня свободных радикалов.
• Определение активности фагоцитов.
• Определение окисляемости липопротеинов.
11. Закон Вавилова: квантовый выход люминесценции не зависит от длины волны возбуждения люминесценции.С. И. Вавиловым установлено, что энергетический выход люминесценции растет пропорционально длине волны возбуждающего света, затем в некотором спектральном интервале он остается постоянным, после чего в области наложения спектров поглощения и люминесценции начинает быстро падать. Падение энергетического выхода свечения происходит в антистоксовской части спектра.
Люминесцентным анализом называется обнаружение и исследование различных объектов с помощью явлений люминесценции. Наиболее важной задачей люминесцентного анализа является определение химического состава исследуемых веществ и установление процентного содержания в них отдельных компонентов. Анализ такого вида носит соответственно название качественного и количественного химического люминесцентного анализа.
1.Качественный химический люминесцентный анализ основан на том, что люминесцентные свойства являются характерным признаком излучающего вещества, тесно связанным с его составом, общим состоянием и структурой его молекул.
2.Количественный химический люминесцентный анализ основан на использовании определенной зависимости между интенсивностью люминесценции и концентрацией люминесцентного вещества..
К люминесцентному анализу относится также изучение структуры и колебательных частот молекул по спектрам излучения, создающее фундамент для качественного люминесцентного анализа.Важным преимуществом люминесцентного анализа являются его простота и скорость, во много раз превосходящие скорость химического анализа.Наиболее распространенным и хорошо разработанным является люминесцентный анализ, основанный на возбуждении фотолюминесценции. При анализе кристаллических неорганических веществ (минералов, алмазов и др.) применяют катодное и рентгеновское возбуждения. В отдельных случаях в аналитических целях используют явления хемилюминесценции и радиолюминесценции.
Спектр флуоресценции (и фосфоресценции) не зависит от длины волны возбуждающего света.Правило Каши относится к форме спектра флуоресценции при возбуждении объекта светом разных длин волн. Испускание квантов флуоресценции всегда происходит с нижнего возбуждённого уровня молекул, независимо от того, на каком уровне оказался электрон в результате поглощения. Т.е. какой бы длиной волны не была возбуждена молекула, излучение будет происходить из одного и того же состояния молекулы.
12. Флуоресцентная спектрофотометрия — это измерение флуоресценции, т. е. фотолюминесценции, испускаемой веществом, подвергнутым воздействию света, ультрафиолетового или другого электромагнитного излучения. Как правило, максимум интенсивности света, испускаемого флуоресцирующим раствором, обнаруживается при длине волны, большей чем максимум возбуждающего света обычно на 20—30 нм.
Интенсивность света, испускаемого флуоресцирующим раствором, при определенных условиях находится в простой зависимости от концентрации растворенного вещества и, следовательно, может быть использована для анализа. Трудно, однако, измерить абсолютную интенсивность флуоресценции, и обычно измерения проводят по отношению к разведениям правильно выбранного стандартного образца. Общая схема флуоресцентной спектроскопии состоит в возбуждении флуоресценции излучением при длине волны максимума поглощения и в измерении или сравнении интенсивности флуоресцирующего света с флуоресценцией определенного стандартного раствора.- Флуоресцирующий свет должен быть тщательно отделен от рассеянного света, падающего на вещество.
Излучение от источника 1 (рис. 1) или /’ падает на зеркальный конденсор 2, который направляет его на плоское поворотное зеркало 3 и дает изображение источника излучения в плоскости линзы 4, расположенной вблизи входной щели 5. Прошедшее
через входную щель излучение падает на зеркальный объектив 6・и, отразившись, параллельным пучком направляется на призму 7. Пройдя призму под углом, близким к углу наименьшего отклонения, и отразившись от ее алюминированной грани, диспергированный пучок направляется обратно на объектив и фокусируется им на выходной щели 8, расположенной над входнойщелью. При вращении призмы монохроматическое излучение различных длин волн проходит через выходную щель 8, линзу 9, контрольный или измеряемый образец, линзу 10 и с помощью поворотного зеркала 11 собирается на светочувствительном слое одного из фотоэлементов 12 или 13. Обьектив представляет собой сферическое зеркало с фокусным расстоянием 500 мм.Диспергирующая призма имеет преломляющий угол З0°,
основание 30 мм и эффективный диаметр 44 мм.
Вопрос 13.
В 1851 Джордж Стокс получил выражение для силы трения (также называемой силой лобового сопротивления), действующей на сферические объекты с очень маленькими числами Рейнольдса (например, очень маленькие частицы) в непрерывной вязкой жидкости, решая уравнение Навье — Стокса:
— сила трения, так же называемая силой Стокса,
— радиус сферического объекта,
Первый закон люминесценции был установлен Стоксом в 1852 г. Согласно закону Стокса, длина волны излучения люминесценции всегда больше длины волны света, возбуждающего люминесценцию.
На рисунке показано, что при освещении люминофора в его спектре присутствуют длины волн и большие, и меньшие тех, которые использовались для его возбуждения. Первая из этих закономерностей является правилом Стокса. А область длин волн, меньших, чем длина волны возбуждающего излучения, называется антистоксовой.
Энергия падающего кванта частично превращается внутри облучаемого тела в другие виды энергии, поэтому энергия кванта люминесценции должна быть меньше.
При столкновении падающего кванта с возбужденным атомом энергия кванта может сложиться с энергией возбуждения. В этом случае возникает квант люминесцентного излучения с энергией, большей энергии света, возбуждающего люминесценцию. Так возникает антистоксова люминесценция.
Фотохи́мия — часть химии высоких энергий, раздел физической химии — изучает химические превращения (химия возбужденных состояний молекул, фотохимические реакции), протекающие под действием света в диапазоне от дальнего ультрафиолета до инфракрасного излучения.
Фотохимические изменения происходят только под действием света, поглощаемого системой (закон Гротгуса — Дрепера, 1818—1843 гг.).
Каждый поглощенный фотон в первичном акте способен активировать только одну молекулу (закон фотохимической эквивалентности Эйнштейна, 1912 г.).
Следующие два закона относятся в основном к фотохимии органических соединений и были сформулированы американским физиком украинского происхождения М. Кашей.
При поглощении каждого фотона молекулой имеется определенная вероятность заселения или самого нижнего синглетного (с мультиплетностью 1) состояния, либо самого нижнего триплетного (с мультиплетностью 3) состояния.
В большинстве органических фотохимических процессов, протекающих в растворах, участвует либо первое возбужденное синглетное, либо первое возбужденное триплетное состояния.
Вопрос 15.
Миграция энергии, перенос энергии, самопроизвольный переход энергии с одной частицы — донора (атома или молекулы) на другую — акцептор. М. э. не связана ни с испусканием фотона донором и его поглощением акцептором, ни с обменом электронами или атомами между взаимодействующими частицами. М. э. — результат электромагнитного взаимодействия частиц (индуктивно-резонансный механизм) либо частичного перекрывания их электронных оболочек (обменно-резонансный механизм). Мигрировать могут разные формы энергии, однако чаще всего М. э. наблюдается после перехода молекулы (атома) в электронно-возбуждённое состояние при поглощении ею кванта света. За время, пока не произошёл обратный процесс излучения света и молекула находится в возбуждённом состоянии, она может передать полученную ею энергию др. молекуле, находящейся достаточно близко, т. е. на расстоянии, меньшем длины волны соответствующего излучения (
Качественный и количественный флуориметрический анализ биомолекул
Качественный И КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ
флуориметрический АНАЛИЗ биомолекул
Спектры люминесценции, как и абсорбционные электронные спектры, используются для качественного и количественного анализа, в структурных исследованиях, для изучения физико–химических свойств сложных молекулярных систем. Люминесцентные методы анализа обладают высокой чувствительностью, в 1000 раз превышающей чувствительность большинства спектрофотометрических методов. Такая высокая чувствительность объясняется тем, что свечение молекул определяют непосредственно, причём его можно усилить или ослабить путём изменения интенсивности возбуждающего света. Особенность люминесцентных методов анализа обусловлена двумя основными факторами. Во-первых, существует относительно небольшое число веществ, обладающих люминесцентной способностью, по сравнению с поглощающими способностями. Во-вторых, в люминесцентном анализе используются две длины волны (возбуждения и испускания), тогда как, например, в спектрофотометрии анализ проводят при одной длине волны.
К недостаткам люминесцентных методов с точки зрения анализа веществ можно отнести зависимость люминесценции молекул от условий окружающей среды (температура, рН, вязкость и т. д.). Но этот недостаток делает люминесцентные методы перспективными для исследования физико–химических процессов в конденсированных средах. Природа таких процессов определяется из спектрально–люминесцентных характеристик молекул, которые носят название люминесцентных зондов. Таким образом, люминесцентные методы служат как для анализа самого вещества обладающего люминесцентной способностью (структурный анализ, качественный и количественный анализ), так и для изучения фотофизических процессов в конденсированных средах с использованием люминесцентных зондов.
Качественный флуориметрический анализ.
Качественный флуориметрический анализ позволяет обнаружить по спектрам флуоресценции (возбуждения и испускания) присутствие определённого вещества в анализируемой пробе. Для отождествления измеренного спектра флуоресценции со спектром какого-либо вещества определяют следующие параметры:
1) количество максимумов в спектре флуоресценции;
2) спектральное положение максимумов ( lmax ) полос флуоресценции;
3) полуширину полос флуоресценции ( Dl1/2 ) — разность между двумя длинами волн, при которых интенсивность флуоресценции составляет половину от максимальной.
При этом необходимо помнить, что экспериментальные условия, при которых проводятся люминесцентные измерения, существенным образом влияют на форму спектра флуоресценции. Так, в частности, все перечисленные выше параметры могут изменяться в зависимости от рН среды, ее температуры, полярности растворителя, концентрации исследуемого вещества и т. д.
1) Исследование спектров испускания флуоресценции.
По спектрам испускания флуоресценции можно проводить качественный анализ веществ. При измерениях спектров испускания люминесценции часто облегчается анализ спектров многокомпонентных систем, поскольку не все поглощающие вещества люминесцируют. Преимуществом флуоресцентного анализа смесей нескольких соединений также является возможность выделения флуоресценции отдельных компонентов путём изменения длины волны возбуждения флуоресценции. Незначительные изменения состояния вещества: агрегация, комплексообразование, изменение кислотно-основного равновесия и т. д. — обычно очень сильно сказываются на его люминесцентных свойствах. Поэтому измерение спектров люминесценции — один из основных методов изучения состояния вещества в биологических системах.
2) Исследование спектров возбуждения флуоресценции.
В связи с тем, что спектр возбуждения люминесценции какого-либо вещества совпадает по форме и положению максимумов со спектром его поглощения, измерение спектра возбуждения люминесценции позволяет установить характеристики спектра поглощения вещества, люминесцирующего в данной спектральной области. Это очень важно для идентификации люминесцирующих веществ. Например, совпадение спектра возбуждения люминесценции разбавленного раствора триптофана с его спектром поглощения, является лучшим доказательством того, что в данной спектральной области люминесцирует именно триптофан, а не примеси. Совпадение спектра возбуждения люминесценции для разбавленных растворов белка со спектром поглощения триптофана свидетельствует о том, что из многих аминокислот, входящих в состав белковых молекул, именно присутствие триптофана обеспечивает люминесценцию в исследуемой спектральной области.
Количественный флуориметрический анализ.
Между интенсивностью флуоресценции (Iф) вещества и его концентрацией (С) существует следующая зависимость:
I0 и I — интенсивности возбуждающего (падающего) и выходящего из образца светового пучка соответственно;
jкв . — квантовый выход люминесценции;
К — коэффициент, характеризующий чувствительность прибора для измерения люминесценции;
Т — пропускание образца при длине волны возбуждения люминесценции;
D — оптическая плотность образца при длине волны возбуждения люминесценции.
Из уравнения (1) видно, что величина Iф меняется в зависимости от D по экспоненциальному закону, и, следовательно, в общем случае между Iф и концентрацией вещества нет линейной зависимости, что осложняет использование измерения Iф для количественного анализа. Однако при небольших значениях D (D £ 0.01) в формуле (1) выражение в скобке можно разложить в ряд, и, ограничиваясь линейным членом, получаем равенство:
e — коэффициент молярной экстинкции люминесцирующего вещества при длине волны возбуждения люминесценции;
С — концентрация люминесцирующего вещества;
l — длина оптического пути возбуждающего света
Таким образом, в определённых пределах оптических плотностей Iф пропорциональна концентрации люминесцирующего вещества (С).
Для определения концентрации вещества по его люминесценции применяют графический метод, основанный на построении калибровочного графика в координатах Iф (C). Для построения калибровочного графика измеряют интенсивность люминесценции серии растворов данного вещества с известной концентрацией. Полученный график должен представлять собой прямую линию, тангенс угла наклона которой равен:
Измерив Iф исследуемого раствора, можно по калибровочному графику определить концентрацию вещества.
Существует несколько факторов, осложняющих точное измерение Iф или её применение для определения концентрации. Главные из них: «паразитный» («рассеянный») свет, экранировка возбуждающего света другими молекулами, реабсорбция исследуемыми молекулами или другими веществами, светорассеяние и неравномерное распределение молекул по объёму, миграция энергии и тушение флуоресценции.
«Паразитный», или «рассеянный» свет, включает в себя излучение источника в спектральной области регистрации флуоресценции, присутствующее в возбуждающем пучке вследствие несовершенства систем его выделения и попадающее на детектор, люминесценцию кюветы и растворителя.
Эффект экранировки возбуждающего света – поглощение части возбуждающего света посторонними молекулами, в результате чего уменьшается количество фотонов, поглощаемых исследуемым веществом, и тем самым снижается Iф.
Если известны значение D исследуемого вещества и общая оптическая плотность ( Dоб. ) образца при длине волны возбуждения, то регистрируемую величину интенсивности флуоресценции можно поправить на эффект экранировки:
Iф’ — интенсивность флуоресценции при наличии экранировки.
Поправочный коэффициент, на который требуется умножить регистрируемую интенсивность флуоресценции вещества в смеси, находится из соотношения:
Реабсорбция заключается во вторичном поглощении квантов флуоресценции. Это явление может быть обусловлено исследуемыми молекулами (собственная реабсорбция) и в этом случае наблюдается лишь в области перекрывания спектра поглощения со спектром флуоресценции. При наличии собственной реабсорбции коротковолновая часть регистрируемого спектра флуоресценции будет заниженной, и к тому же его максимум окажется сдвинутым в длинноволновую область по сравнению с истинным спектром излучения. В многокомпонентных образцах кванты флуоресценции исследуемого вещества могут поглощаться молекулами других соединений, и это также сопровождается ослаблением свечения. Характер изменений формы спектра флуоресценции, в этом случае, полностью определяется формой спектра поглощения других веществ. Эффект реабсорбции увеличивается с возрастанием оптической плотности образца в области регистрации флуоресценции.
Так же, как и в случае эффекта экранировки, эффект реабсорбции можно учесть. Если известно значение оптической плотности исследуемого вещества при длине волны возбуждения флуоресценции ( D ) и значение оптической плотности образца при длине волны испускания флуоресценции ( Dф) , то регистрируемую величину интенсивности флуоресценции можно поправить на эффект реабсорбции:
Iф’’ — интенсивность флуоресценции при наличии реабсорбции.
Поправочный коэффициент, на который требуется умножить регистрируемую интенсивность флуоресценции вещества в смеси, находится из соотношения:
Особенности измерения флуоресценции биологических объектов.
1. Интенсивность люминесценции биологических объектов часто бывает довольно низкой. Это объясняется малой величиной квантовых выходов люминесценции, низкой концентрацией люминесцирующих веществ, экранирующим эффектом других компонентов. Измерение слабой люминесценции осложнено «паразитной» люминесценцией кювет, оптики, примесей и т. д. Для преодоления этих трудностей требуется аппаратура с повышенной чувствительностью, хорошая фокусировка света на образец, правильный выбор условий измерения и тщательный контроль на флуоресценцию кювет и растворителя.
2. При изучении люминесценции исследуемый образец подвергается воздействию интенсивного возбуждающего света, что может приводить к значительным изменениям фотохимически активных веществ в излучающей системе. Чем выше интенсивность возбуждающего света, тем лучше условия для измерения люминесценции, но зато тем сильнее разрушительное действие возбуждающего света. Выход из этого противоречия может быть найден при сочетании нескольких приёмов:
1) уменьшением яркости возбуждающего света на объекте за счёт увеличения площади пятна;
2) повышением чувствительности приёмника света и светосилы прибора;
3) увеличением скорости измерений;
4) понижением температуры.
Объект должен освещаться возбуждающим светом только в самый момент измерения, а в остальное время возбуждающий свет должен быть перекрыт специальной шторкой. В тех случаях, когда измерения люминесценции можно производить в одной точке, открывать возбуждающий свет следует только в момент отсчёта.
3. При измерениях люминесценции всегда приходиться считаться с сильным светорассеянием, свойственным биологическим объектам. Интенсивность возбуждающего света обычно на несколько порядков превышает интенсивность люминесценции, поэтому при сильном светорассеянии измерения люминесценции невозможны, даже если незначительная часть возбуждающего света пропускается в спектральной области люминесценции. Поэтому необходимо производить контроль на рассеянный свет, производя измерения с растворителем или же используя в качестве контроля какой-нибудь сильно рассеивающий, но не люминесцирующий объект (например, окись магния).
Светорассеяние не только затрудняет измерение люминесценции, но и осложняет анализ спектров вследствии увеличения оптического пути света в рассеивающем образце (как возбуждающего, так и света флуоресценции). Это приводит к появлению всех эффектов, характерных для объектов с высокой оптической плотностью: к возрастанию интенсивности люминесценции, к увеличению экранирующего эффекта и к усилению реабсорбции. Основными путями уменьшения нежелательных эффектов могут быть:
1) измерение в тонких слоях и при малых концентрациях;
2) выбор оптимальной области возбуждения;
3) уменьшение светорассеяния.
При замораживании светорассеяние сильно увеличивается. Поэтому при охлаждении образца наблюдается скачкообразное увеличение интенсивности люминесценции при температуре замерзания растворителя. Одновременно усиливается проявление всех других эффектов, связанных со светорассеянием.
4. Неравномерное распределение исследуемых молекул по объёму приводит к уменьшению оптической плотности (эффект «сита»). По этой причине неоднородные объекты флуоресцируют слабее однородных даже при условии одинаковой средней концентрации вещества. Исключить влияние этого эффекта иногда удаётся с помощью соответствующего подбора длин волн возбуждения.
Цель работы: практическое освоение аппаратуры и методов качественного и количественного флуориметрического анализа биомолекул и их смесей.
Приборы, принадлежности и реактивы
1) Спектрофлуориметр Hitachi MPF-4.
2) Спектрофотометр СФ-46.
3) Кювета для измерения флуоресценции (кварцевая кювета с двумя перпендикулярными прозрачными гранями и длиной оптического пути 1 см), кварцевые кюветы для измерения оптической плотности на спектрофотометре с длиной оптического пути 1 см.
4) Растворы исследуемых веществ.
1. Качественный флуориметрический анализ.
1. Ознакомиться (с помощью преподавателя) с устройством и принципом работы спектрофлуориметра.
Получить у преподавателя стандартный раствор исследуемого вещества с известной концентрацией (опытный образец) и растворитель (холостой раствор).
3. Измерить на спектрофлуориметре спектр испускания флуоресценции опытного образца.
Для этого на монохроматоре возбуждения флуоресценции выставить длину волны ( Excitationwavelength ), соответствующую наиболее длинноволновому максимуму в спектре поглощения исследуемого вещества. Установить щель монохроматора возбуждения ( ExcitationSlit ) на значение 5 нм.
На монохроматоре испускания флуоресценции выставить длину волны ( Emissionwavelength ) на 5-10 нм больше, чем выбранная длина волны возбуждения флуоресценции (установленная длина волны должна быть кратна 10). Установить щель монохроматора испускания ( EmissionSlit ) на значение 5 нм.
Установить значение переключателя чувствительности ( SampleSensitivity ) в положение «10».
Установить необходимую скорость регистрации спектра ( ScanSpeed ).
Поместить кювету с исследуемым образцом в кюветное отделение прибора.
Открыть шторку прибора (положение «.»).
Замечание.Категорически запрещается открывать кюветное отделение прибора при открытой шторке!
Сканировать монохроматор испускания в диапазоне длин волн от выбранной начальной длины волны испускания до 800 нм.
Закрыть шторку прибора (положение « S »).
4. На полученном спектре найти полосу испускания для которой наблюдается наибольшая интенсивность флуоресценции. Определить в ней значение интенсивности и спектрального положения максимума. Полученное значение интенсивности флуоресценции должно лежать в интервале от 0,3 до 1,0 В по шкале регистрирующего устройства. При значениях, отличающихся от этого диапазона, необходимо подобрать соответствующее положение переключателя SampleSensitivity и заново отсканировать спектр.
5. Измерить на спектрофлуориметре спектр возбуждения флуоресценции опытного образца.
Для этого на монохроматоре испускания флуоресценции выставить длину волны ( Emissionwavelength ), соответствующую наиболее интенсивному максимуму в спектре испускания флуоресценции исследуемого вещества. Установить щель монохроматора испускания ( EmissionSlit ) на значение 5 нм.
На монохроматоре возбуждения выставить длину волны ( Excitationwavelength ) 200 нм. Установить щель монохроматора возбуждения ( ExcitationSlit ) на значение 5 нм.
Установить значение переключателя чувствительности ( SampleSensitivity ) в положение, подобранное при регистрации спектра испускания.
Установить необходимую скорость регистрации спектра ( ScanSpeed ).
Открыть шторку прибора (положение «.»).
Замечание.Категорически запрещается открывать кюветное отделение прибора при открытой шторке!
Сканировать монохроматор возбуждения от 200 нм до длины волны, которая будет на 10 нм меньше, чем выбранная длина волны испускания флуоресценции.
Закрыть шторку прибора (положение « S »).
Извлечь кювету с опытным образцом из кюветного отделения прибора.
6. Измерить спектры возбуждения и испускания флуоресценции для холостого раствора при тех же условиях, что и опытный раствор.
7. Найти разность значений интенсивности флуоресценции опытного и холостого раствора для спектров возбуждения и испускания флуоресценции исследуемого вещества при каждой длине волны.
8. Нормировать полученные разностные спектры. Для этого необходимо определить в каждом спектре максимальное значение интенсивности флуоресценции. Затем разделить значения интенсивности флуоресценции данного спектра при каждой длине волны на интенсивность его максимального значения.
9. На рисунке 1 построить в одной системе координат нормированные спектры возбуждения и испускания флуоресценции исследуемого вещества. Сделать все необходимые обозначения и подписи.
10. На полученных спектрах определить количество максимумов, интенсивность максимумов, спектральное положение максимумов, полуширину полос флуоресценции, определить «стоксов» сдвиг для исследуемого образца в данном растворителе.
Сформулировать и записать выводы по данному заданию.
2. Исследование спектра испускания флуоресценции при различных длинах волн возбуждения.
Для исследования использовать опытный образец из задания 1. На спектрофлуориметре измерить спектры испускания флуоресценции опытного образца при длинах волн возбуждения, соответствующих максимумам в спектре возбуждения исследуемого соединения (использовать полученные результаты и условия измерения из задания 1). Определить на полученных спектрах интенсивность и длину волны в максимумах полос испускания. Данные занести в таблицу 1.
Примечание.lвозб — длина волны возбуждения флуоресценции, lисп. , Iисп.— длина волны испускания и интенсивность флуоресценции опытного образца.
Сделать предположение о количестве люминесцирующих компонентов в исследуемом образце. Сформулировать и записать выводы по данному заданию.
3. Количественный флуориметрический анализ.
1. Получить у преподавателя исходный раствор исследуемого вещества с известной концентрацией (маточный раствор), раствор того же вещества с неизвестной концентрацией (задача) и растворитель.
Из маточного раствора и растворителя приготовить серию разведений с концентрациями в диапазоне от исходной до 0,01 мкМ (не менее 9 растворов с разными концентрациями равномерно захватывающими этот диапазон). Используя данные полученные в задании 1, выбрать аналитические длины волн возбуждения и испускания флуоресценции для исследуемого вещества. Длины волн должны быть выбраны таким образом, чтобы они не попадали на область перекрывания этих спектров. Измерить интенсивность флуоресценции приготовленных разведений, задачи и растворителя при фиксированных длинах волн возбуждения и испускания.
Для этого на монохроматоре возбуждения флуоресценции ( Excitationwavelength ) выставить выбранную аналитическую длину волны возбуждения флуоресценции. Установить щель монохроматора возбуждения ( ExcitationSlit ) на значение 10 нм.
На монохроматоре испускания флуоресценции ( Emissionwavelength ) выставить выбранную аналитическую длину волны испускания флуоресценции. Установить щель монохроматора испускания ( EmissionSlit ) на значение 10 нм.
Установить значение переключателя чувствительности ( SampleSensitivity ) в положение «30».
Поместить кювету с исследуемым образцом в кюветное отделение прибора.
Открыть шторку прибора (положение «.»).
Замечание.Категорически запрещается открывать кюветное отделение прибора при открытой шторке!
Регистрировать интенсивность флуоресценции в течение одной минуты.
Закрыть шторку прибора (положение « S »).
На полученной кинетике измерить среднее значение интенсивности флуоресценции образца. Если среднее значение интенсивности флуоресценции получается больше 1 В по шкале регистрирующего устройства, то повторить регистрацию при положении переключателя чувствительности ( SampleSensitivity ) равном «3» (уменьшение чувствительности в 10 раз).
Определить среднее значение и стандартное отклонение интенсивности флуоресценции для каждого образца (опытный раствор) и растворителя (холостой раствор). Найти разность значений между каждым опытным и холостым раствором. Данные занести в таблицу 2.
Примечание.С — концентрация исследуемого вещества, Iср. и s — средняя интенсивность и стандартное отклонение интенсивности флуоресценции образца.
I– разность интенсивностей флуоресценции опытного и холостого раствора.
На рисунке 2 построить зависимость интенсивности флуоресценции ( I ) от концентрации ( C ) исследуемого вещества. Около каждой точки указать разброс экспериментальных данных ( s ). Сделать все необходимые обозначения и подписи. Найти на графике линейный участок зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации. Применить к этому участку метод линейной регрессии. Найти уравнение регрессионной кривой. Используя найденное уравнение, определить неизвестную концентрацию исследуемого вещества (задача). Определить коэффициент чувствительности и порог чувствительности флуориметрического определения данного вещества. Сформулировать и записать выводы по данному заданию.
4. Количественный флуориметрический анализ при наличии эффектов внутреннего фильтра.
, г (2. 1)
, (2. 2)
где:
— число излучённых квантов,
— число поглощённых квантов.
P + фотон -Испускание кванта света
Интенсивность света, испускаемого флуоресцирующим раствором, при определенных условиях находится в простой зависимости от концентрации растворенного вещества и, следовательно, может быть использована для анализа. Трудно, однако, измерить абсолютную интенсивность флуоресценции, и обычно измерения проводят по отношению к разведениям правильно выбранного стандартного образца. Общая схема флуоресцентной спектроскопии состоит в возбуждении флуоресценции излучением при длине волны максимума поглощения и в измерении или сравнении интенсивности флуоресцирующего света с флуоресценцией определенного стандартного раствора.- Флуоресцирующий свет должен быть тщательно отделен от рассеянного света, падающего на вещество.
