Уравнение трипептида гли ала вал

Инсулин – популярнейшая
молекула XX столетия

В истории химии случались события, по своему драматизму напоминавшие штурм неприступной вершины, на которую пытаются взойти одновременно независимые группы альпинистов по различным маршрутам. Все это сопровождается обстановкой состязания – кто взойдет на вершину первым?

Далее речь пойдет о синтезе инсулина – событии, ставшем заметным достижением в химической науке. Точно так же, как перед штурмом вершины альпинисты создают базовые, промежуточные и штурмовые лагеря, синтез инсулина был хорошо подготовлен, но не теми, кто вышел на покорение вершины, а основательными работами исследователей-предшественников. Можно уверенно сказать, что создание исходного плацдарма впечатляет не меньше, чем последующий штурм. Инсулин по праву можно назвать популярнейшей молекулой ХХ столетия; с исследованиями этого соединения связаны имена семи (!) нобелевских лауреатов.

Белок, спасающий жизнь

В середине XX в. инсулин был одним из наиболее интенсивно изучаемых веществ. Причина в том, что удалось объяснить происхождение одного из тяжелейших заболеваний – сахарного диабета. Болезнь возникает, когда в организме недостаточно гормона* инсулина. Инсулин запускает процессы, обеспечивающие поступление глюкозы (сахара) в клетки, а также стимулирует внутриклеточные механизмы, позволяющие усваивать глюкозу.

При недостатке инсулина глюкоза не расходуется клетками, она накапливается в крови и начинает через почки поступать в мочу. Повышенный уровень глюкозы в крови и ее выведение с мочой приводят к похуданию, чрезмерному мочеотделению, постоянному ощущению сильной жажды и голода. Организм старается компенсировать дефицит калорий, которые он теряет с мочой в виде глюкозы, и начинает использовать жировые запасы и тканевые белки (главным образом мышечные). Возникают утомление, сонливость, тошнота, нарушаются обменные процессы, что может привести к диабетической коме, а при отсутствии лечения к смерти.

Сахарный диабет встречается среди населения всех стран и у представителей всех рас. Самое раннее описание этого заболевания было сделано примерно 3000 лет назад в Древней Индии. Подробные симптомы болезни (обильное мочеотделение, чрезмерная жажда и потеря веса) были описаны в I в. н.э. Болезнь получила свое название от греческого diabetes, что означает «протекаю, прохожу сквозь» (имеется в виду чрезмерное мочеотделение).

Планомерное изучение этого заболевания длилось не одно столетие. В XVII в. английский врач Т.Уиллис обратил внимание на то, что моча у пациентов с такими симптомами имеет сладковатый вкус (провести подобный анализ мог только истинный ученый). Картина начала проясняться после опытов французского физиолога Клода Бернара (1813–1878), в которых он наблюдал собак с удаленной поджелудочной железой. Его опыты продолжили в 1889 г. немецкие физиологи Йозеф фон Меринг и Оскар Минковский. Они удаляли хирургическим путем поджелудочную железу у собак и затем наблюдали у них резкий подъем концентрации глюкозы в крови, ее появление в моче и другие признаки сахарного диабета. Таким образом они экспериментально доказали связь между поджелудочной железой и сахарным диабетом.

Д.Маклеод
(1876–1935)

Некоторые физиологи высказывали предположение, что поджелудочная железа вырабатывает вещество, которое способствует усваиванию в организме глюкозы. В 1916 г. немецкий физиолог Шарпи-Шафер назвал это гипотетическое вещество инсулин (от латинского insula – островок, поскольку отчетливо наблюдаемые группы клеток поджелудочной железы к этому моменту именовали островками Лангерганса). Тогда это было только предположение, которое впоследствии полностью подтвердилось.

Ф.Бантинг
(1891–1941)

В 1921 г. трое канадских исследователей – профессор физиологии университета в г. Торонто (Канада) Джон Маклеод, врач-хирург Фредерик Бантинг и врач-физиолог Чарлз Бест сумели выделить инсулин из поджелудочной железы подопытных животных. Первые же опыты по введению полученного препарата собакам с удаленной поджелудочной железой продемонстрировали значительное снижение уровня сахара в крови животных и улучшение клинической картины.

Ч.Бест
(1899–1978)

11 января 1922 г. (знаменательный факт в истории мировой медицины) более чистый и активный препарат инсулина был введен первому пациенту – подростку, страдавшему тяжелой формой диабета. После полученного положительного эффекта были проведены аналогичные испытания еще на нескольких пациентах. Возникло новое направление в медицинской науке – гормонотерапия.

В 1923 г. Маклеод и Бантинг были удостоены Нобелевской премии по физиологии и медицине «за открытие инсулина». Бест не был включен в список лауреатов, и Бантинг отдал ему половину полученных денег (жест, достойный истинного ученого).

В 1926 г. было налажено серийное производство инсулина. Многие тысячи больных сахарным диабетом, ранее обреченных на смерть, были спасены и могли вести сравнительно нормальную жизнь, регулярно принимая лекарство.

От медицины к химии

Физиологи Маклеод и Бантинг использовали для лечения больных экстракт поджелудочной железы животных. Однако химиков всегда интересовало, как именно устроено то или иное соединение. Инсулин в кристаллическом виде впервые сумел получить в 1926 г. Дж.Абель. Именно благодаря его работам удалось наладить промышленное производство препарата. Абель также определил состав инсулина, стало понятно, что вещество представляет собой белковую молекулу. C этого момента исследования инсулина из медицины переходят в область химии, точнее, в руки биохимиков.

Ф.Сенгер
(р. 1918)

Все упомянутые выше работы подготовили решающий этап, позволивший выяснить, как устроена молекула, привлекавшая внимание столь большого числа исследователей. Решить эту задачу удалось американскому биохимику Фредерику Сенгеру. Вначале он разработал способ идентификации концевых аминогрупп в белковой молекуле путем обработки в щелочной среде динитрофторбензолом (впоследствии этот метод стал классическим). Далее он буквально разобрал на части всю молекулу инсулина и определил состав полученных аминокислот с помощью самых современных методов – электрофореза, разработанного А.Тизелиусом (Нобелевская премия, 1948 г.) и хроматографии, усовершенствованной А.Мартином и Р.Сингом (нобелевские лауреаты, 1952 г.). Однако установить, из каких аминокислот собрана белковая молекула, лишь половина дела, притом менее сложная. Главное – выяснить их последовательность в цепи.

Сенгер разработал план, по которому с помощью специально подобранных ферментов (биологических катализаторов) проводил расщепление белковой цепи на небольшие отрезки в заранее намеченных участках, а потом сопоставлял их состав. Работа представляла собой безупречное сочетание логики и экспериментального мастерства, и в 1958 г. ученому была присуждена Нобелевская премия «за работы по структуре протеинов, особенно инсулина». Свой метод Сенгер довел буквально до совершенства, со временем его методика стала общим принципом исследования структуры белков.

Винсент
Дю Виньо
(1901–1978)

Попутно отметим, что Сенгер, применив похожие логические построения, но несколько изменив методику и используемые реагенты, сумел установить последовательность фрагментов в структуре знаменитой двойной спирали ДНК. За эти исследования в 1980 г. Сенгеру (совместно с У.Гилбертом и П.Бергом) была присуждена еще одна Нобелевская премия «за вклад в определение последовательности оснований в нуклеиновых кислотах». Таким образом, Сенгер – единственный дважды нобелевский лауреат по химии. Никто не мог предположить, что эти исследования ДНК со временем откроют новую страницу в химии инсулина, но об этом речь пойдет несколько позже.

Дороти
Кроуфут-Ходжкин
(1910–1994)

Американский биохимик Винсент Дю Виньо, в течение нескольких лет изучавший инсулин, узнав о работах Сенгера, решил воспользоваться его методикой для расшифровки структуры двух других гормонов (вазопрессина и окситоцина). Однако он не только установил строение, но и синтезировал молекулы этих гормонов. Фактически он был первым, кто сумел синтезировать природные полипептиды. Эта работа ученого была отмечена Нобелевской премией в 1955 г., т.е. он получил премию на три года раньше Сенгера, чьи идеи помогли ему добиться столь великолепного результата. Работы Дю Виньо фактически открыли дорогу к синтезу инсулина.

Тем временем изучение инсулина продолжалось. Исследование лечебных свойств инсулина позволило установить, что его цинковый комплекс из нескольких молекул, так называемый Zn-инсулин, обладает более длительным лечебным действием. Строение этого комплекса оказалось весьма сложным (он содержит почти 800 атомов), поэтому были привлечены физико-химические методы анализа. В 1972 г. английский биофизик Дороти Кроуфут-Ходжкин (лауреат Нобелевской премии 1964 г. за определение с помощью рентгеновских лучей структур биологически активных веществ) установила трехмерную структуру этого необычайно сложного комплекса.

Упрощенный язык биохимиков

Прежде чем рассмотреть строение молекулы инсулина, познакомимся с тем, как биохимики изображают молекулы белков.

Все белки представляют собой полимеры, цепи которых собраны из фрагментов аминокислот. Аминокислоты – это органические соединения, содержащие в своем составе аминогруппу NH2 и карбоксильную группу СООН. В образовании белков участвуют только такие аминокислоты, у которых между аминогруппой и карбоксильной группой всего один углеродный атом. В общем виде они могут быть представлены формулой H2N–CH(R)–COOH. Группа R, присоединенная к атому углерода (тому, который находится между амино- и карбоксильной группой), определяет различие между аминокислотами, образующими белки. Эта группа может состоять только из атомов углерода и водорода, но чаще содержит помимо С и Н различные функциональные группы. Из всего многообразия существующих аминокислот (теоретически количество возможных аминокислот неограниченно) в образовании белков участвуют только двадцать, так называемые «фундаментальные» аминокислоты. Для «строительства» инсулина природа использовала 16 аминокислот (из допустимых двадцати) (табл.1).

Аминокислоты, участвующие в создании инсулина

НазваниеСтруктураОбозначение*
ГлицинГли
АланинАла
ВалинВал
ЛейцинЛей
ИзолейцинИле
СеринСер
ЦистеинЦис
ЛизинЛиз
АргининАрг
АспарагинАсн
Глутаминовая кислотаГлу
ГлутаминГлн
ФениаланинФен
ТирозинТир
ГистидинГис
ПролинПро

* В международной практике принято сокращенное обозначение перечисленных аминокислот с помощью латинских трехбуквенных сокращений, например глицин – Gly, аланин – Ala и т.п.

Белковая молекула образуется в результате последовательного соединения аминокислот, при этом карбоксильная группа одной кислоты взаимодействует с аминогруппой соседней молекулы, в результате образуется пептидная связь –CO–NH– и выделяется молекула воды. На схеме 1
(см. с. 6) показано последовательное соединение аланина, валина и глицина.

Из превращений, показанных на схеме 1, следует, что при любом количестве соединяемых аминокислот на одном конце возникшей цепочки обязательно будет находиться аминогруппа, а на другом – карбоксильная. Фрагменты соединенных аминокислот обозначены (под фигурными скобками) теми сокращенными буквосочетаниями, которые указаны в табл. 1. Таким образом, вместо структурной формулы мы можем использовать сокращенное обозначение получившегося трипептида: ала-вал-гли. Поскольку количество аминокислот, используемых природой, всего двадцать, то подобные сокращения позволяют компактно записать формулу любого белка, и никакой неясности при этом не возникнет.

Молекула инсулина, как установил Сенгер, состоит из 51 аминокислотного остатка (это один из самых короткоцепочечных белков) и представляет собой две соединенные между собой параллельные цепи неодинаковой длины. На схеме 2 показана последовательность аминокислот в молекуле инсулина: А-цепь содержит 21 аминокислотный остаток, Б-цепь – 30.

Содержащиеся в молекуле остатки аминокислоты цистеина (сокращенное обозначение Цис) образуют дисульфидные мостики S-S-, которые связывают две полимерные цепи молекулы и, кроме того, образуют перемычку внутри А-цепи. При таком компактном изображении белковой молекулы символы химических элементов используют только для обозначения дисульфидных мостиков и концевых групп (NH2 и COOH).

Для сравнения далее показана структурная формула инсулина в виде объемной шаростержневой модели (схема 3).

Согласитесь с тем, что биохимики выбрали компактный и необычайно удобный для написания способ изображения белковых молекул.

От демонтажа к сборке

Казалось бы, после того как установлена структура молекулы, синтезировать ее заново не составит большого труда.

Основная трудность при сборке белковой молекулы – добиться, чтобы необходимые аминокислоты соединялись в строго определенном порядке. При этом нужно учитывать, что аминокислота способна реагировать не только с другой аминокислотой, но и сама с собой, и в итоге может получиться молекула, не имеющая ничего общего с тем, что синтезирует живой организм.

К моменту, когда решался вопрос о синтезе инсулина, было разработано несколько соответствующих методик. Для того чтобы аминокислота, которую намечено было присоединить к растущей цепи, не реагировала сама с собой, ее реакционноспособные концы (аминогруппу NH2 и карбоксильную группу СООН) блокировали специальным образом: карбоксильную группу переводили в п-нитрофениловый эфир, а со стороны аминогруппы присоединяли карбоксибензильную группу. Такая блокированная молекула реагировала с аминогруппой, находящейся на конце растущей цепи, по схеме 4 (cм. c. 8).

В результате растущая цепь удлинялась на одно пептидное звено. Однако теперь на конце цепи разместилась блокирующая карбоксибензильная группа. Чтобы сделать «аминный хвост» реакционноспособным, т. е. перевести его в активную форму, осуществляли обработку бромоводородом с уксусной кислотой по схеме 5 (cм. c. 8).

В результате аминогруппа на конце цепи (она показана в виде аммониевой соли с HBr) вновь была готова реагировать с очередной аминокислотой (естественно, тоже содержащей блокирующие группы). Параллельно были разработаны и другие методы сборки полипептидных цепей.

К полному синтезу инсулина в 1962 г. приступили практически одновременно три группы исследователей: группа П.Катсоянниса в г. Питсбурге (США), группа Г.Цана в г. Аахене (Германия), а также группа китайских химиков (Шанхай и Пекин). Все три группы действовали по весьма похожим стратегиям: собрали отдельно короткую и длинную цепи из заготовленных фрагментов, а затем соединяли обе цепи дисульфидными мостиками.

Аахенская группа Г.Цана (он в центре)

Короткую А-цепь все три группы исследователей собирали из двух одинаковых блоков.

1-й блок: гли-иле-вал-глу-глн-цис-цис-тир-сер;

2-й блок: иле-цис-сер-лей-тир-глн-лей-глу-асн-тир-цис-асн.

Длинную Б-цепь собирали из четырех полипептидных блоков, однако длина этих блоков у разных групп ученых несколько различалась (табл. 2).

Полипептидные блоки для сборки Б-цепи инсулина

Исследова-
тельская группа
1-й блок2-й блок3-й блок4-й блок
АахенскаяФен-вал-асн-глн-
гис-лей-цис-гли
Сер-гис-лей-
вал-глу-ала
Лей-тир-лей-
вал-цис-глу
Глу-арг-глу-фен-фен-
тир-тир-про-лиз-тир
ПитсбургскаФен-вал-асн-глн-
гис-лей-цис-гли-сер
Гис-лей-вал-глуАла-лей-тир-лей-
вал-цис-глу
Глу-арг-глу-фен-фен-
тир-тир-про-лиз-тир
Пекинско-
шанхайская
Фен-вал-асн-глн-
гис-лей-цис-гли
Сер-гис-лей-вал-
глу-ала-лей-тир
Лей-вал-цис-глуГлу-арг-глу-фен-фен-
тир-тир-про-лиз-тир

Различия возникли из-за того, что методы соединения блоков и способы промежуточной защиты, используемые каждой из исследовательских групп, были неодинаковы. Естественно, на последнем этапе у всех групп получились одинаковые цепи. Приблизительно год ушел на создание исходных блоков. Подстегиваемая обстановкой соревнования аахенская группа интенсифицировала работу и в декабре 1963 г. сообщила об успешном синтезе инсулина. Эта группа буквально вырвала первенство у питсбургских химиков, которые сообщили об успешном результате в марте 1964 г. Окончательный выход чистого продукта колебался в пределах 0,02–0,07%. У китайских химиков выход был несколько выше (1,2–2,5%); разумеется, о производстве инсулина по таким методикам не могло быть и речи.

Питсбургская группа П.Катсоянниса
(он второй справа)

Синтез инсулина стал убедительной победой классической синтетической химии пептидов. Несмотря на низкий выход продукта, все признавали, что была проделана выдающаяся работа, которая позволила изменить образ мышления химиков, сформулировать новые принципы сборки больших молекул, отработать стратегию синтеза и подобрать оптимальные методики. Все это заметно повысило общий уровень органической химии. Тем не менее истинного триумфа не получилось, потому что почти одновременно с успешным завершением этих работ появилась принципиально иная, более совершенная методика сборки белковых молекул.

Главное – закрепить хвост

Профессор Рокфеллеровского университета (Нью-Йорк) Роберт Меррифилд, занимаясь химией белков, высказал оригинальную идею: первую аминокислоту можно закрепить одним концом на некой нерастворимой поверхности (носителе). Затем следует присоединить к другому ее концу следующую аминокислоту, при этом нежелательные побочные продукты и промежуточные реагенты, не вступившие в реакцию, можно будет вымывать из реакционного сосуда после каждой стадии, а растущий полипептид, прикрепленный к носителю, останется при этом незатронутым. Молекулы растущих полипептидов будут подвешены «за хвост» к твердой поверхности носителя, а когда процесс синтеза завершится, конечный полипептид можно отделить от носителя.

Меррифилду удалось реализовать эту идею. Первую аминокислоту присоединяют к нерастворимому полимерному гелю (сшитый полистирол) с введенными в него хлорметильными группами CH2Cl, которые способны реагировать с СООН-группами аминокислоты. Чтобы взятая для реакции аминокислота не прореагировала сама с собой и не присоединилась аминогруппой к подложке, NH2-группу этой кислоты предварительно блокируют объемистым заместителем – [(С4Н9)3]3ОС(О)-группой. После того как аминокислота присоединилась к полимерной подложке, блокирующую группу удаляют и в реакционную смесь вводят другую аминокислоту, у которой также предварительно заблокирована NH2-группа. В такой системе возможно только взаимодействие NH2-группы первой аминокислоты и COOH-группы второй аминокислоты, которое проводят в присутствии катализаторов (солей фосфония). Далее схему присоединения повторяют, вводя третью аминокислоту. Вся схема синтеза полипептидных цепей, позволяющая чередовать аминокислотные остатки в заданном порядке, выглядит следующим образом (схема 6).

На последней стадии полученные полипептидные цепи отделяют от полистирольной подложки действием HBr в присутствии трифторуксусной кислоты F3CCOOH.

Р.Меррифилд
(р. 1921 г.)

Меррифилд не только экспериментально проверил эффективность предложенного метода, но и сконструировал аппарат, который практически автоматизировал пептидный синтез. Это устройство представляло собой контейнер для аминокислот и реагентов – реакционный сосуд с автоматическими впускным и выпускным клапанами и программным механизмом, который регулировал последовательность процессов и длительность каждой стадии.

С помощью сконструированного аппарата Меррифилд и его коллеги синтезировали инсулин всего за 20 дней (притом с выходом в десятки процентов), в то время как «первопроходцы» – аахенская, питсбургская и шанхайская группы – затратили на это больше года.

В 1985 г. Меррифилд был удостоен Нобелевской премии «за развитие методологии твердофазного химического синтеза».

Во время проведения описанных выше работ химиков не оставляла мысль, что те задачи, которые ученые решают с таким трудом, Природа решает легко и исключительно аккуратно. Синтез белков в живых организмах проходит в мягких условиях, быстро и без образования побочных продуктов. До определенного момента химики могли лишь с удивлением и интересом наблюдать подобные «синтезы», однако стремительное развитие биохимии позволило активно вмешаться в эти процессы, в том числе открыть принципиально новый способ синтеза инсулина.

Ранее было сказано, что Ф.Сенгер (установивший структуру инсулина) сумел определить последовательность фрагментов в структуре ДНК, за что был удостоен второй Нобелевской премии. Эта работа позволила биохимикам перейти к следующему этапу – встраивать в генетический код ДНК заранее намеченные фрагменты. Основная идея состояла в том, чтобы в ДНК некоторых бактерий включать гены высших организмов. В результате бактерии приобретают способность синтезировать соединения, которые прежде могли синтезировать только высшие организмы. Такая технология получила название «генная инженерия».

В 1981 г. канадский биохимик Майкл Смит был приглашен в научные соучредители новой биотехнологической компании «Зимос». Один из первых контрактов фирмы был заключен с датской фармацевтической компанией «Ново» по разработке технологии производства человеческого инсулина в дрожжевой культуре. В результате совместных усилий инсулин, полученный по новой технологии, в 1982 г. поступил в продажу. В 1993 г. за цикл работ в этой области М.Смит (совместно с К.Муллисом) получил Нобелевскую премию. В настоящее время инсулин, получаемый методом генной инженерии, практически вытеснил инсулин животных.

Чьи работы важнее

М.Смит (1932–2000)

Итак, мы познакомились с четырьмя способами получения инсулина: экстракцией из поджелудочной железы животных (группа Д.Маклеода), многоступенчатым синтезом (группа Г.Цана), автоматизированной сборкой (Р.Меррифилд), методом генной инженерии (М.Смит). Оставим в стороне медицинский аспект проблемы, сосредоточим внимание на химии. Могло сложиться впечатление, что работы Смита сделали ненужными все предшествующие исследования. На самом деле это не так, все методы неразрывно связаны, ни один из этапов упомянутых исследований нельзя «выбросить». Инсулин, выделенный из поджелудочной железы животных, позволил Сенгеру определить его структуру, а без этого последующий синтез был невозможен. Группа Цана разработала химические приемы сборки цепей и способы промежуточной блокировки функциональных групп, которыми воспользовался Меррифилд при создании автоматической установки синтеза. Работы Смита, по существу, опирались на весь предшествующий опыт, накопленный при изучении инсулина. При синтезе некоторых короткоцепочечных гормонов автоматическая установка Меррифилда технически оказалась предпочтительнее «генной инженерии».

Обобщая, можно сказать, что все этапы, которые мы рассмотрели, – это естественный, традиционный и, если не бояться торжественных слов, величественный путь науки.

* Гормоны (от греческого – привожу в действие, побуждаю) – специфические физиологически активные вещества, вырабатываемые специальными эндокринными органами или тканями, секретируемые в кровь или лимфу и действующие на строение и функции организма.

Лекция № 16. Аминокислоты. Пептиды

  1. Методы получения.
  2. Химические свойства.
  3. Аминокислоты, входящие в состав белков.
  4. Пептиды
  1. Методы получения.
  2. Химические свойства.
  3. Аминокислоты, входящие в состав белков.
  4. Пептиды

Аминокислоты – гетерофункциональные соединения, содержащие
карбоксильную и аминогруппы. По взаимному расположению функциональных групп
различают a -, b -, g — и т.д. аминокислоты.
Аминокислоты, содержащие аминогруппу на конце цепи, называют w -аминокислотами.

1. Методы получения

!) Аммонолиз галогензамещенных кислот.

Метод используется для синтеза a -аминокислот из доступных a -галогензамещенных кислот.

2) Метод Штеккера- Зелинского

Включает стадии образования аминонитрила при
взаимодействии альдегида с HCN и NH 3 c последующим гидролизом его в аминокислоту. В качестве
реагента применяют смесь NaCN и NH 4Cl.

Метод применим для синтеза только a -аминокислот.

3) Восстановительное аминирование
оксокислот

4) Присоединение аммиака к a , b -непредельным карбоновым кислотам.

Метод применим для синтеза b -аминокислот.

5) Из оксимов циклических кетонов
перегруппировкой Бекмана.

Метод используется для синтеза w -аминокислот.

2. Химические
свойства

Аминокислоты дают реакции, характерные для карбоксильной
и аминогрупп, и, кроме того, проявляют специфические свойства, которые
определяются наличием двух функциональных групп и их взаимным
расположением.

2.1. Кислотно-основные
свойства

Аминокислоты содержат кислотный и основный
центры и являются амфотерными соединениями. В кристаллическом состоянии они
существуют в виде внутренних солей (биполярных ионов), которые образуются в
результате внутримолекулярного переноса протона от более слабого основного
центра (СОО — ) к более сильному
основному центру (NH 2).

Ионное строение аминокислот подтверждается их
физическими свойствами. Аминокислоты – нелетучие кристаллические вещества с
высокими температурами плавления. Они нерастворимы в неполярных органических
растворителях и растворимы в воде. Их молекулы обладают большими дипольными
моментами.

Форма существования аминокислот в водных
растворах зависит от рН. В кислых растворах аминокислоты присоединяют протон и
существуют преимущественно в виде катионов. В щелочной среде биполярный ион
отдает протон и превращается в анион.

При некотором значении рН, строго определенном
для каждой аминокислоты, она существует преимущественно в виде биполярного иона.
Это значение рН называют изоэлектрической точкой ( рI ). В
изоэлектрической точке аминокислота не имеет заряда и обладает наименьшей
растворимостью в воде. Катионная форма аминокислоты содержит два кислотных
центра (COOH и NH 3 + ) и
характеризуется двумя константами диссоциации рКа1 и рКа2.
Значение рI определяется по уравнению:

2.2. Реакции по
аминогруппе

Аминокислоты содержат первичную аминогруппу и подобно первичным аминам
взаимодействуют с азотистой кислотой с выделением азота. При этом происходит
замещение аминогруппы на гидроксильную.

Реакция используется для количественного
определения аминокислот по объему выделившегося азота (метод Ван-Слайка).

Алкилирование и
арилирование

При взаимодействии аминокислот с избытком
алкилгалогенида происходит исчерпывающее алкилирование аминогруппы и образуются
внутренние соли.

Аминокислоты арилируются 2,4-динитрофторбензолом
(ДНФБ) в щелочной среде. Реакция протекает как нуклеофильное замещение в
активированном ароматическом кольце.

Реакция используется для установления
аминокислотной последовательности в пептидах.

Аминокислоты взаимодействуют с ангидридами и
хлорангидридами с образованием N-ацильных производных.

Реакция используется для защиты аминогруппы в
синтезе пептидов. Такая защита должна легко сниматься, а амиды, как известно,
гидролизуются в жестких условиях. При разработке методов синтеза пептидов были
найдены защитные группы, которые легко удаляются путем гидролиза или
гидрогенолиза.

трет -Бутоксикарбонильная защита
(БОК-защита).

Легкость снятия защиты обусловлена устойчивостью
бензил- и трет-бутил-катионов, которые образуются в качестве
интермедиатов.

2.3. Реакции по карбоксильной
группе

При сухой перегонке в присутствии гидроксида
бария аминокислоты декарбоксилируются с образованием аминов.

Аминокислоты взаимодействуют со спиртами в присутствии газообразного HCl как
катализатора с образованием сложных эфиров.

В отличие от самих аминокислот, их сложные эфиры
– легко летучие соединения и могут быть разделены путем перегонки или
газожидкостной хроматографии, что используется для анализа и разделения смесей
аминокислот, полученных при гидролизе белков.

Получение галогенангидридов и
ангидридов

При действии на защищенные по аминогруппе
аминокислоты галогенидов фосфора или серы образуются хлорангидриды.

Реакция используется для активации карбоксильной
группы при нуклеофильном замещении. Чаще для этой цели получают смешанные
ангидриды, которые являются более селективными ацилирующими реагентами.

Реакция используется для активации аминогруппы в
синтезе пептидов.

2.4. Специфические реакции
аминокислот

Реакции с одновременным участием карбоксильной и
аминогрупп идут, как правило, с образованием продуктов, содержащих
термодинамически устойчивые 5-ти- и 6-тичленные гетероциклы.

a -Аминокислоты
образуют прочные хелатные комплексы с ионами переходных металлов (Cu, Ni, Co, Cr
и др.).

Отношение аминокислот к
нагреванию

Превращения аминокислот при нагревании зависят от взаимного расположения
карбоксильной и аминогруппы и определяются возможностью образования
термодинамически стабильных 5-ти- 6-тичленных циклов

a -Аминокислоты
вступают в реакцию межмолекулярного самоацилирования. При этом образуются
циклические амиды – дикетопиперазины.

b -Аминокислоты при
нагревании переходят a , b -непредельные кислоты.

g — и d -Аминокислот претерпевают
внутримолекулярное ацилирование с образованием циклических амидов – лактамов .

При взаимодействии a -аминокислот с трикетоном – нингидрином происходит одновременное окислительное
дезаминирование и декарбоксилирование с образованием альдегида и окрашенного
продукта конденсации.

Реакция используется для количественного анализа
аминокислот методом фотометрии.

Природные аминокислоты отвечают общей формуле RCH(NH2 )COOH и отличаются строением радикала R. Формулы и
тривиальные названия важнейших аминокислот приведены в таблице. Для
биологического функционирования аминокислот в составе белков определяющим
является полярность радикала R. По этому признаку аминокислоты разделяют на
следующие основные группы (см. таблицу).

Таблица. Важнейшие a -аминокислоты
RCH(NH2)COOH

ФормулаНазваниеОбозначениеpI
Аминокислоты, содержащие
неполярный радикал R
ГлицинGly5,97
АланинAla6,0
ВалинVal5,96
ЛейцинLeu5,98
ИзолейцинIle6,02
ФенилаланинPhe5,48
ТриптофанTrp5,89
ПролинPro6,30
МетионинMet5,74
Цистин(Cys)25,0
Аминокислоты, содержащие полярный
неионогенный радикал R
СеринSer5,68
Треонин

5,60

ГидроксипролинHyp5,8
АспаргинAsn5,41
ГлутаминGln5,65
Аминокислоты, содержащие полярный
положительно заряженный радикал R
ЛизинLys9,74
5-Гидроксилизин9,15
АргининArg10,76
ГистидинHis7,59
Аминокислоты, содержащие полярный
отрицательно заряженный радикал R
Аспаргиновая
кислота
Asp2,77
Глутаминовая
кислота
Gly3,22
ТирозинTyr5,66
ЦистеинCys5,07

Аминокислоты, содержащие неполярный радикал
R. Такие группы
располагаются внутри
молекулы белка и обуславливают гидрофобные взаимодействия.

Аминокислоты, содержащие полярный
неионогенный радикал R.
Аминокислоты этого типа имеют в составе бокового радикала полярные группы, не
способные к ионизации в водной среде (спиртовый гидроксил, амидная группа).
Такие группы могут располагаться как внутри, так и на поверхности молекулы
белка. Они участвуют в образовании водородных связей с другими полярными
группами.

Аминокислоты, содержащие радикал R, способный
к ионизации в водной среде с образованием положительно или отрицательно
заряженных групп.
Такие аминокислоты содержат в боковом радикале
дополнительный основный или кислотный центр, который в водном растворе может
соответственно присоединять или отдавать протон.

В белках ионогенные группы этих аминокислот
располагаются, как правило, на поверхности молекулы и обуславливают
электростатические взаимодействия.

Все природные a -аминокислоты (кроме глицина)
являются хиральными соединениями. По конфигурации хирального центра в положении
2 аминокислоты относят D- или L-ряду.

Природные аминокислоты относятся к
L-ряду.

Большинство аминокислот содержат один хиральный
центр и имеют два стереоизомера. Аминокислоты изолейцин, треонин,
гидроксипролин, 5-гидроксилизин и цистин содержат два хиральных центра и имеют
(кроме цистина) 4 стереоизомера, из которых только один встречается в составе
белков.

Так, из 4-х стереоизомеров треонина в
природе встречается только (2S,3R)-2-амино-3-гидроксибутановая кислота.

Использование для построения белков только
одного вида стереоизомеров имеет важное значение для формирования их
пространственной структуры и обеспечения биологической активности.

a -Аминокислоты,
полученные синтетическим путем, представляют рацемические смеси, которые
необходимо разделять. Наиболее предпочтительным является ферментативный способ
разделения с помощью ферментов ацилаз, способных гидролизовать N-ацетильные
производные только L- a -аминокислот. Ферментативное расщепление проводят по
следующей схеме.

Сначала рацемическую аминокислоту ацилируют
уксусным ангидридом:

Затем рацемическую смесь ацетильных производных
подвергают ферментативной обработке. При этом гидролизуется ацетильное
производное только L-аминокислоты:

Полученная после ферментативного смесь легко
разделяется, так как свободная L-аминокислота растворяется и в кислотах, и в
щелочах, а ацилированная – только в щелочах.

3.3. Кислотно-основные
свойства.

По кислотно-основным свойствам аминокислоты
разделяют на три группы.

Нейтральные аминокислоты не содержат в
радикале R дополнительных кислотных или основных центров, способных к ионизации
в водной среде. В кислой среде они существуют в виде однозарядного катиона и
являются двухосновными кислотами по Бренстеду. Как видно на примере аланина,
изоэлектрическая точка у нейтральных аминокислот не равна 7, а лежит в интервале
5,5 – 6,3.

Основные аминокислоты содержат в
радикале R дополнительный основный центр. К ним относятся лизин, гистидин и
аргинин. В кислой среде они существуют в виде дикатиона и являются трехосновными
кислотами. Изоэлектрическая точка основных аминокислот, как видно на примере
лизина, лежит в области рН выше 7.

Кислые аминокислоты содержат в
радикале R дополнительный кислотный центр. К ним относятся аспаргиновая и
глутаминовая кислоты. В кислой среде они существуют в виде катиона и являются
трехосновными кислотами. Изоэлектрическая точка этих аминокислот лежит в области
рН много ниже 7.

Тирозин и цистеин содержат в боковых радикалах
слабые кислотные центры, способные к ионизации при высоких значениях рН.

Важное значение имеет тот факт, что при
физиологическом значении рН (

7) ни одна аминокислота не находится в
изоэлектрической точке. В организме все аминокислоты ионизированы, что
обеспечивает им хорошую растворимость в воде.

Различие в кислотно-основных свойствах
используется для разделения аминокислот методом электрофореза и ионообменной
хроматографии. При данном значении рН разные аминокислоты могут иметь разный по
величине и знаку электрический заряд. Например, при рН6 лизин имеет заряд +1 и
движется к катоду, аспаргиновая кислота имеет заряд –1 и перемещается к аноду, а
аланин находится в изоэлектрической точке и не перемещается в электрическом поле. Таким образом при рН6 они могут быть
разделены с помощью электрофореза.

Для разделения аминокислот методом ионообменной
хроматографии используют катионообменные смолы (сульфированный полистирол).
Процесс ведут в кислой среде, когда аминокислоты находятся катионной
форме.

Скорость продвижения аминокислот по
хроматографической колонке зависит от силы их электростатических и гидрофобных
взаимодействий со смолой. Наиболее прочно связываются со смолой основные
аминокислоты, имеющие наибольший положительный заряд, наименее прочно – кислые
аминокислоты. Наибольшим гидрофобным связыванием со смолой обладают аминокислоты
с неполярными боковыми радикалами, особенно ароматическими. Таким образом,
порядок элюирования аминокислот следующий. Легче других элюируются кислые
аминокислоты (Asp и Glu), следом за ними идут аминокислоты, содержащие полярные
неионогенные группы (Ser, Thr, Asn, Gln), затем из колонки вымываются
аминокислоты с неполярными боковыми радикалами (Phe, Trp, Ile и др.) и в
последнюю очередь элюируются основные аминокислоты (His, Lys, Arg).

Восстановительное аминирование – метод
синтеза a -аминокислот из a -оксокислот при участии кофермента НАД Н в качестве
восстанавливающего реагента.

Трасаминирование основной
путь биосинтеза аминокислот. При трансаминировании происходит взаимообмен двух
функциональных групп – аминной и карбонильной между аминокислотой и кетокилотой.
При этом нужная для организма аминокислота 1 синтезируется из аминокислоты 2,
имеющейся в клетках в избыточном коичестве. Реакция осуществляется при участии
ферментов трансаминаз и кофермента пиридоксальфосфата.

Содержащий альдегидную группу пиридоксальфосфат
служит переносчиком аминогруппы в виде основания Шиффа.

Аминокислоты декарбоксилируются под действием
ферментов декарбоксилаз при участи кофермента пиридоксальфосфата. При этом
образуются биогенные амины.

Биогенные амины обладают ярко выраженной
биологической активностью. Важнейшими из них являются — коламин (предшественник
в синтезе холина и нейромедиатора ацетилхолина), гистамин (обеспечивает
аллергические реакции организма), g -аминомасляная кислота (нейромедиатор), адреналин
(гормон надпочечников, нейромедиатор)

Неокислительное дезаминирование происходит путем
отщепления аммиака под действием ферментов с образованием a , b -непредельных кислот.

Окислительное дезаминирование происходит
при участии ферментов оксидаз и кофермента НАД + , который выступает в качестве окислителя. В результате
выделяется аммиак и образуется соответствующая кетокислота.

С помощью реакций дезаминирования снижается
избыток аминокислот в организме.

Петиды – это полиамиды, построенные из a -аминокислот. По числу аминокислотных остатков в
молекуле пептида различают дипептиды, трипептиды, тетрапептиды и т.д.
Пептиды, содержащие до 10 аминокислотных остатков, называют олигопептидами, более 10 аминокислотных остатков – полипептидами.
Природные полипептиды, включающие более 100 аминокислотных остатков, называют белками .

Формально пептиды можно рассматривать как продукты поликонденсации
аминокислот.

Аминокислотные остатки в пептиде связаны
амидными (пептидными) связями. Один конец цепи, на котором находится
аминокислота со свободной аминогруппой, называют N-концом. Другой конец,
на котором находится аминокислота со свободной карбоксильной группой, называют С-концом. Пептиды принято записывать и называть, начиная с
N-конца.

Название пептида строят на основе тривиальных
названий, входящих в его состав аминокислотных остатков, которые перечисляют,
начиная с N-конца. При этом в названиях всех аминокислот за исключением
С-концевой суффикс “ин” заменяют на суффикс “ил”. Для сокращенного обозначения
пептидов используют трехбуквенные обозначения входящих в его состав
аминокислот.

Пептид характеризуется аминокислотным
составом
и аминокислотной последовательностью.

Аминокислотный состав пептида может быть
установлен путем полного гидролиза пептида (расщепления до аминокислот) с
последующим качественным и количественным анализом образовавшихся аминокислот
методом ионобменной хроматографии или ГЖХ-анализом сложных эфиров аминокислот.
Полный гидролиз пептидов проводят в кислой среде при кипячении их с 6н.
HCl.

Одному и тому же аминокислотному составу
отвечает несколько пептидов. Так, из 2-х разных аминокислот может быть построено
2 дипептида, из трех разных аминокислот – 6 трипептидов, из n разных аминокислот
n! пептидов одинакового состава. Например, составу Gly:Ala:Val=1:1:1 отвечают
следующие 6 трипептидов.

Gly-Ala-Val Gly- Val-Ala Val-Gly-Ala Val-Ala-Gly Ala-Gly-Val
Ala-Val-Glu

Таким образом, для полной характеристики пептида
необходимо знать его аминокислотный состав и аминокислотную
последовательность.

4.2. Определение аминокислотной
последовательности

Для определения аминокислотной
последовательности используют комбинацию двух методов: определение концевых
аминокислот и частичный гидролиз .

Определение N-концевых
аминокислот.

Метод Сегнера . Пептид обрабатывают 2,4-динитрофтробензолом (ДНФБ), а
затем полностью гидролизуют. Из гидролизата выделяют и идентифицируют
ДНФ-производное N-концевой аминокислоты.

Метод Эдмана состоит во
взаимодействии N-концевой аминокислоты с фенилизотиоцианатом в щелочной среде.
При дальнейшей обработке слабой кислотой без нагревания происходит отщепление от
цепи “меченой” концевой аминокислоты в виде фенилгидантоинового (ФТГ)
производного.

Преимущество этого метода состоит в том, что при
отщеплении N-концевой аминокислоты пептид не разрушается и операцию по
отщеплению можно повторять. Метод Эдмана используют в автоматическом приборе –
секвенаторе, с помощью которого можно осуществить 40 – 50 стадий отщепления,
идентифицируя полученные на каждой стадии ФТГ-производные методом газожидкостной
хроматографии.

Частичный гидролиз полипептидов

При частичном гидролизе пептиды расщепляются с
образованием более коротких цепей. Частичный гидролиз проводят с помощью
ферментов, которые гидролизуют пептидные связи избирательно, например, только с
N-конца (аминопептидазы) или только с С-конца (карбоксипептидазы).
Существуют ферменты, расщепляющие пептидные связи только между определенными
аминокислотами. Меняя условия гидролиза, можно разбить пептид на различные
фрагменты, которые перекрываются по составляющим их аминокислотным остаткам.
Анализ продуктов частичного гидролиза позволяет воссоздать структуру исходного
пептида. Рассмотрим простейший пример установления структуры трипептида.
Частичный гидролиз по двум разным направлениям трипептида неизвестного строения
дает продукты представленные на схеме.

Единственный трипептид, структура которого не
противоречит продуктам частичного гидролиза – Gly-Ala-Phe.

Установление аминокислотной последовательности
пептидов, содержащих несколько десятков аминокислотных остатков, – более сложная
задача, которая требует комбинации различных методов.

Синтез пептида с заданной аминокислотной
последовательностью – чрезвычайно сложная задача. В простейшем случае синтеза
дипептида из 2-х разных аминокислот возможно образование 4-х разных
продуктов.

В настоящее время разработана стратегия синтеза
пептидов, основанная на использовании методов активации и защиты функциональных групп на соответствующих этапах синтеза. Процесс синтеза
дипептида включает следующие стадии:

    1. защита аминогруппы N-концевой
      аминокислоты;
    2. активация карбоксильной группы N-концевой
      аминокислоты;
    3. конденсация модифицированных
      аминокислот
    4. снятие защитных групп

Таким образом, последовательно присоединяя
аминокислоты, шаг за шагом наращивают цепь полипептида. Такой синтез очень
длителен, трудоемок и дает низкий выход конечного продукта. Основные потери
связаны с необходимостью выделения и очистки продуктов на каждой стадии.

Этих недостатков лишен используемый в настоящее
время твердофазный синтез пептидов. На первой стадии защищенная по
аминогруппе С-концевая аминокислота закрепляется на твердом полимерном носителе
(полистироле, модифицированном введением групп –CH 2 Cl). После снятия защиты проводят ацилирование
аминогруппы закрепленной на носителе аминокислоты другой аминокислотой, которая
содержит активированную карбоксильную и защищенную аминогруппу. После снятия
защиты проводят следующую стадию ацилирования. Отмывание продукта от примесей
проводят прямо на носителе и лишь после окончания синтеза полипептид снимают с
носителя действием бромистоводородной кислоты. Твердофазный синтез
автоматизирован и проводится с помощью приборов – автоматических
синтезаторов.

;

Методом твердофазного синтеза получено большое
количество пептидов, содержащих 50 и более аминокислотных остатков, в том числе
инсулин (51 аминокислотный остаток) и рибонуклеаза (124 аминокислотных
остатка).


источники:

http://studentik.net/lekcii/lekcii_xmia/3085-lekcija-15-aminokisloty-peptidy.html