ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 7. Лабораторная работа 7 Обмен белков и нуклеиновых кислот Цель работы изучить важнейшие свойства аминокислот и белков
Название | Лабораторная работа 7 Обмен белков и нуклеиновых кислот Цель работы изучить важнейшие свойства аминокислот и белков |
Анкор | ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 7.doc |
Дата | 05.05.2017 |
Размер | 377 Kb. |
Формат файла | |
Имя файла | ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 7.doc |
Тип | Лабораторная работа #7060 |
страница | 2 из 3 |
Подборка по базе: Практическая работа 3.docx, Курсовая работа Морозова А.docx, русский язык и культура речи контрольная работа.docx, контрольная работа английский язык.docx, КУРСОВАЯ РАБОТА.docx, ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 1-2.docx, Контрольная работа Материаловедение.docx, ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА №1 Конституционное право Ч.1 (ТЕКСТ ЗАДАНИЯ , Самостоятельная работа по теме 1.5..docx, ПИСЬМЕННАЯ РАБОТА №1 БЖД.pdf 1. Нормы потребления белка и структура белкового питания. 2. Что такое незаменимые аминокислоты? 3. Какова роль соляной кислоты желудочного сока в переваривании белков? 4. Под влиянием каких ферментов пищеварительного тракта и через какие промежуточные продукты протекает последовательный распад белков до аминокислот? 5. Участие аминокислот в пластическом обмене (синтез белков, реакции переаминирования и декарбоксилирования). 6. Участие белков в энергетическом обмене (мобилизация, реакция окислительного дезаминирования аминокислот). 7. Конечный продукт обмена белков (где образуется, как устраняется из организма?). Лабораторная работа № 7 Свойства белков Существует два типа цветных реакций: 1) универсальные – биуретовая (на все белки) и нингидриновая (на все а-аминокислоты и белки); При проведении цветных реакций на белки и аминокислоты необходимо предварительно составить следующую таблицу:
В пробирку наливают 1 мл. неразбавленного куриного белка добавляют 2 мл. концентрированного раствора щелочи, кладут несколько кипятильников. К горячему раствору добавляют раствор плюмбита натрия – образуется желто-бурое или черное окрашивание. (Плюмбит натрия готовят следующим образом: к 1 мл уксуснокислого свинца добавляют раствор щелочи по каплям до растворения образующего вначале осадка гидроксида свинца). При наличии в молекуле белка серосодержащих аминокислот (цистина, цистеина) из этих аминокислот постепенно отщепляется сера в виде иона в степени окисления – 2, наличие которого и обнаруживается ионом свинца, образующим с ионом серы черный нерастворимый сульфид свинца: Pb(CH3COO)2 + 2NaOH Pb(OH)2 + 2 CH3COONa, Na2S + Na2PbO2 + 2H2O PbS + 4NaOH. Оформление опыта: сделать вывод и написать уравнение реакции. Рассмотрим механизм ксантопротеиновой реакции по радикалу тирозина: Рассмотрим механизм ксантопротеиновой реакции по радикалу тирозина:
Оформление опыта: сделать вывод и написать уравнение реакции. Эту же реакцию на триптофан можно провести, используя вместо уксусной кислоты формальдегид 2,5%-ный раствор концентрированной H2SO4. Раствор перемешать и через 2-3 мин. добавить при взбалтывании 10 капель 5%-ного нитрита натрия. Развивается интенсивно-фиолетовое окрашивание, на этом основан принцип метода реакции. Через 5-10 минут на границе раздела двух слоев наблюдают образование красно-фиолетового кольца.
Реакция с нингидрином используется для визуального обнаружения a-аминокислот на хроматограммах (на бумаге, в тонком слое), а также для колориметрического определения концентрации аминокислот по интенсивности окраски продукта реакции. Продукт этой реакции содержит в своем составе радикал (R) исходной аминокислоты, который обусловливает различную окраску: голубую, красную, и т.д. соединений, возникающих при реакции аминокислот с нингидрином. В настоящее время нингидриновая реакция широко используется как для открытия отдельных аминокислот, так и для определения их количества. Опыт 6. Реакция Сакагучи. Принцип метода. Эта реакция на аминокислоту аргинин основана на взаимодействии аргинина с a-нафтолом в присутствии окислителя. Ее механизм еще полностью не выяснен. По-видимому, реакция осуществляется по следующему уравнению: Поскольку производные хинониминов (в данном случае нафтохинона), у которых водород иминогруппы –NH– замещен на алкильный или арильный радикал, всегда окрашены в желто-красные тона, то, по-видимому, оранжево-красный цвет раствора при проведении реакции Сакагучи объясняется возникновением именно производного нафтохинонимина. Не исключена, однако, вероятность образования еще более сложного соединения за счет дальнейшего окисления оставшихся NH-групп аргининового остатка и бензольного ядра a-нафтола: Немедленно добавляют 1 мл 40%-го раствора мочевины для стабилизации, быстро развивающегося оранжево-красного окрашивания. NH = C –NH2, и указывает на присутствие в белковой молекуле аминокислоты-аргинина: Известно, что белки в растворе сохраняются в природном состоянии за счёт факторов устойчивости, к которым относятся заряд белковой молекулы и гидратная (водная) оболочка вокруг нее. Удаление этих факторов приводит к склеиванию этих молекул белка и выпадению в осадок. Осаждение белков может быть обратимым и необратимым в зависимости от природы используемых реактивов. Обратимое осаждение – при этом процессе под воздействием факторов осаждения белки выпадают в осадок, но после прекращения действия этих факторов белки вновь переходят в растворимое состояние и приобретают свои нативные свойства. Одним из видов обратимого осаждения белков является высаливание. Необратимое осаждение белков связано с глубокими нарушениями структуры белков (вторичной и третичной) и потерей ими нативных свойств. Такие изменения белков можно вызвать кипячением, действием концентрированных растворов минеральных и органических кислот, солями тяжелых металлов. Для высаливания белков используют соли щелочных и щелочноземельных металлов (наиболее часто в практике используют сульфат натрия и аммония). Эти соли удаляют водную оболочку (вызывают обезвоживание) и снимают заряд. Между величиной водной оболочки белковых молекул и концентрацией солей существует прямая зависимость: чем меньше гидратная оболочка, тем меньше требуется солей. Так, глобулины, имеющие крупные и тяжелые молекулы и небольшую водную оболочку, выпадают в осадок при неполном насыщении раствора солями, а альбумины как более мелкие молекулы, окруженные большой водной оболочкой, – при полном насыщении. Денатурация белка (необратимое осаждение) сводится к разрушению третичной и частично вторичной структуры белковой молекулы врезультате разрыва водородных связей и потере им биологических или нативных свойств. При необратимых реакциях осаждения белки претерпевают глубокие изменения и не могут быть растворимы в первоначальном растворителе. К необратимым реакциям относятся осаждение белка солями тяжелых металлов, минеральными и органическими кислотами, алкалоидными реактивами и осаждение при кипячении. Насыщенным раствором сульфата аммония осаждается альбуминовая фракция белков, полунасыщенным раствором – глобулиновая фракция. Сущность реакции заключается в дегидратации молекул белка. Порядок выполнения работы. Получают полунасыщенный раствор сульфата аммония и также смешивают (1:1) с яичным белком, при этом глобулиновая фракция осаждается, а альбуминовая остается в растворе. Последнюю отфильтровывают, затем смешивают с порошком сульфата аммония до тех пор, пока не прекратится растворение соли, при этом выпадает осадок – альбумины. К образовавшимся осадкам (глобулинов и альбуминов) добавляют воду и наблюдают их растворение. Это доказывает, что высаливание – процесс обратимый. Высаливание белков сульфатом аммония уравнение реакцииРеакции осаждения белков 4. Реакции осаждения белков Белки в растворе и соответственно в организме сохраняются в нативном состоянии за счет факторов устойчивости, к которым относятся заряд белковой молекулы и гидратная оболочка вокруг нее. Удаление этих факторов приводит к склеиванию молекул белков и выпадению их в осадок. Осаждение белков может быть обратимым и необратимым в зависимости от реактивов и условий реакции. В клинической лабораторной практике реакции осаждения используют для выделения альбуминовой и глобулиновой фракций белков плазмы крови, количественной характеристики их устойчивости в плазме, обнаружения белков в биологических жидкостях и освобождения от них с целью получения без белкового раствора. Под действием факторов осаждения белки выпадают в осадок, но после прекращения действия (удаления) этих факторов белки вновь переходят в растворимое состояние и приобретают свои нативные свойства. Одним из видов обратимого осаждения белков является высаливание. Высаливание. Насыщенным раствором сульфата аммония осаждается альбуминовая фракция белков, полунасыщенным раствором — глобулиновая фракция. 1) неразведенный яичный белок; 2) насыщенный раствор сульфата аммония; 3) NaOH, 10% раствор, 4) CuSO 4 , 1% раствор; 5) дистиллированная вода; 6) сульфат аммония в порошке. Ход определения. В пробирку наливают 30 капель неразведенного яичного белка и добавляют равное количество насыщенного раствора сульфата аммония. Содержимое пробирки перемешивают. Получают полунасыщенный раствор сульфата аммония, при этом глобулиновая фракция осаждается, а альбуминовая остается в растворе. Последнюю отфильтровывают, затем смешивают с порошком сульфата аммония до тех пор пока не прекратится растворение соли, при этом выпадает осадок — глобулины. Необратимое осаждение белков. Необратимое осаждение белков связано с глубокими нарушениями структуры белков (вторичной и третичной) и потерей ими нативных свойств. Такие изменения белков можно вызвать кипячением, действием концентрированных растворов минеральных и органических кислот, солями тяжелых металлов. Осаждение при кипячении. Белки являются термолабильными соединениями и при нагревании свыше 50-60 градусов С денатурируются. Сущность тепловой денатурации заключается в разрушении гидратной оболочки, разрыве стабилизирующих белковую глобулу связей и развертывании белковой молекулы. Наиболее полное и быстрое осаждение происходит в изоэлектрической точке (когда заряд молекулы равен нулю), поскольку частицы белка при этом наименее устойчивы. Белки, обладающие кислыми свойствами, осаждаются в слабокислой среде, а белки с основными свойствами — в слабощелочной. В сильнокислых или сильнощелочных растворах денатурированный при нагревании белок в осадок не выпадает, т.к. его частицы перезаряжаются и несут в первом случае положительный, а во втором — отрицательный заряд, что повышает их устойчивость в растворе. 1) яичный белок, 1% раствор; 2) уксусная кислота, 1% и 10% растворы; 3) NaOH, 10% раствор. Ход определения. В 4 пронумерованные пробирки приливают по 10 капель раствора яичного белка. Затем 1-ю пробирку нагревают до кипячения, при этом раствор мутнеет, но т.к. частицы денатурированного белка несут заряд, они в осадок не выпадают. Это связано с тем, что яичный белок имеет кислые свойства (его изоэлектрическая точка 4,8) и в нейтральной среде заряжен отрицательно; во вторую пробирку добавляют 1 каплю 1% раствора уксусной кислоты и нагревают до кипячения. Белок выпадает в осадок, т.к. его раствор приближается к изоэлектрической точке и белок теряет заряд (один из факторов устойчивости белка в растворе); в 3-ю пробирку добавляют 1 каплю 10% раствора уксусной кислоты и нагревают до кипения. Осадка не образуется, т.к. в сильнокислой среде частицы белка приобретают положительный заряд (сохраняется один из факторов устойчивости белка в растворе); в 4-ю пробирку наливают 1 каплю раствора NaOH, нагревают до кипения. Осадок не образуется, поскольку в щелочной среде отрицательный заряд белка увеличивается. Осаждение концентрированными минеральными кислотами. Концентрированные кислоты (серная, хлористоводородная, азотная и др.) вызывают денатурацию белка за счет удаления факторов устойчивости белка в растворе (заряда и гидратной оболочки). Однако при избытке хлористоводородной и серной кислоты выпавший осадок денатурированного белка снова растворяется. По-видимому, это происходит в результате перезарядки молекул белка и частичного их гидролиза. При добавлении избытка азотной кислоты растворения осадка не происходит. Вот почему для определения малых количеств белка в моче при клинических исследованиях применяется азотная кислота. 1) яичный белок,1% раствор; 2) концентрированная серная кислота; 3) концентрированная хлористоводородная кислота; 4) концентрированная азотная кислота. Ход определения. В три пробирки наливают по 5 капель концентрированной серной, хлористоводородной и азотной кислот. затем, наклонив пробирку под углом 45 градусов, осторожно по стенке наслаивают такой же объем яичного белка. На границе двух слоев появляется осадок белка в виде белого кольца. Осторожно встряхивают пробирки, наблюдают растворение белка в пробирках с серной и хлористоводородной кислотами, в пробирке с азотной кислотой растворения белка не происходит. Осаждение органическими кислотами. Трихлоруксусная кислота осаждает только белки, а сульфосалициловая осаждает не только белки, но и высокомолекулярные пептиды. Сульфосалициловой кислотой пользуются при определении белка в моче. 1) яичный белок, 1% раствор; 2) трихлоруксусная кислота, 10% раствор; 3) сульфосалициловая кислота, 10% раствор. Ход определения. В две пробирки вносят по 5 капель раствора белка. В одну из них прибавляют 2 капли сульфосалициловой кислоты, а в другую — 5 капель трихлоруксусной кислоты. В пробирках выпадает осадок белка. Осаждение белка солями тяжелых металлов. Белки при взаимодействии с солями свинца, меди, ртути, серебра и других тяжелых металлов денатурируются и выпадают в осадок. Однако при избытке некоторых солей наблюдается растворение первоначально образовавшегося осадка. Это связано с накоплением ионов металла на поверхности денатурированного белка и появлением положительного заряда на белковой молекуле. 1) яичный белок, 1% раствор; 2) сульфат меди, 10% раствор; 3) ацетат свинца, 5% раствор; 4) нитрат серебра, 5% раствор. Ход определения. В три пробирки вносят по 5 капель белка. В первую добавляют 1 каплю ацетата свинца, в третью — 1 каплю нитрата серебра. Во всех пробирках выпадает осадок. Затем в первую пробирку добавляют 10 капель нитрата серебра — растворения осадка нет. Высаливание белков сульфатом аммония уравнение реакцииОбычно, когда говорят о высаливании, имеют в виду высаливание именно сульфатом аммония. Этому методу уже более 130 лет. Раньше он применялся и для фракционирования, сейчас, в основном, как дешёвый и удобный метод осаждения белков. Можно считать, что повезло, если при этом получается ещё и существенная очистка (при высаливании из клеточного экстракта можно расчитывать на приблизительно 2-10 кратное обогащение).
2- имеет 13-14 молекул H2O только в первом гидратном слое и, возможно, больше — во втором. Если одна молекула сульфата координирует даже 15 молекул H2O, то 3M сульфат аммония связывает 45 из имеющихся в воде 55M молекул H2O.
Например, для 1M NaCl: I = 1 /2 (1(1) 2 + 1(1) 2 ) = 1
Обычно, при концентрациях ниже 1М (25% от насыщения) осаждаются лишь крупные частицы, преагрегированные или очень крупные белки. Приемлемая серия концентраций: 0M; 1M(25%); 1.6M(40%); 2.4M(60%); 3.2M(80%). Можно добавлять кристаллический ацетат аммония или насыщенный раствор (а если требуется высокая точность, то 4М раствор). Первый способ удобнее, когда требуется высокая концентрация сульфата аммония или не хочется сильно увеличивать объём образца. В любом случае, соль добавляется при непрерывном перемешивании, чтобы не создавалась слишком высокая локальная концентрация соли. Чем выше температура, тем ниже растворимость белков, но тем выше опасность денатурировать белок. Обычно осаждение проводится при 0 o C, хотя благодаря тому, что (NH4)2SO4 стабилизирует белки и предотвращает рост бактерий, её можно проводить и при 25 o C. Можно добавить только одно: проблема соосаждения примесных белков не отражена в должной мере. Для достижения равновесия, а значит максимальной степени очистки (она может быть существенной) раствору (суспензии) белка стоит постоять в холодильнике не один день (если хватит терпения). Имеется опыт. Смотри также: |
Дополнения, комментарии, вопросы Растворимость сульфата аммония в воде при 20 С около 5.7М, причем при 0 градусов снижается примерно на 0,5М, не верите, возьмите справочник, или проверьте сами. В разделе осаждение белков сульфатом аммония в примере с рассчётом ионной силы(второй случай), по-моему необходимо читать:I=1/2*(2*(1)^2+1*(2)^2), поскольку заряд сульфат иона, записанный в скобках во втором слагаемом, равен 2. Тогда и ответ получается верным Изучал высаливание билихромопротеидов (фикоцианина и фикоэритрина) синезелёных водорослей в 1974 году. Белки ярко окрашены и за их поведением очень удобно наблюдать. При этих наблюдениях выяснилось, что «в действительности всё совсем не так, как на самом деле». Для полного перехода белков из раствора в осадок достаточно изменить насыщенность раствора сульфата аммония всего на 0,1. 0,2%. Но осадок вблизи этой концентрации (точки осаждения) очень неустойчив. Растворяется даже от вибрации центрифуги. Поэтому для его отделения от раствора можно использовать только фильтрование, причём с очень низкими скоростями (1. 2 мл/см2 в минуту). Сам знаю, что это противоречит всем канонам, но это было подтверждено не только фильтрованием, но и измерением оптической плотности растворов при различных концентрациях соли. При длительном стоянии растворов с повышающимися концентрациями сульфата аммония без вибрации и перемешивания оптическая плотность окрашенных белков на графике растворимости падает почти отвесно. Для осаждения иммуноглобулинов из желтка яиц, я использовал аммония сульфат в конечной концентрации 50%, однако центифугированием никак не удалось осадит преципитат.Во всех случаях получался пленка состаяшаяся из липопротеидов и иммуноглобулинов. Новейшие данные о рядах Гофмейстера читайте в статье: скажите пожалуйста как влияет размер белка на эффективность его высаливания сернокислым аммонием, Для эффективности высаливания важнее конечная концентрация белка в растворе и соотношение гидрофильных и гидрофобных аминокислотных остатков на поверхности глобулы. Конечно, белки меньше 5-10 кДа высаливать труднее, потому что мелкие гидрофобные частицы слипаются и осаждаются хуже. Правда тут есть ухищрения: можно добавить несколько баластных белков (выпадающих при разных насыщающих концентрациях и, от которых потом легко избавиться) с ними легче соосаждаются маленькие белки в низкой концентрации. 2 Maya: A eshe mojno precipitirovat «bolshie» belki,esli takovie prisutstvujut v smesi,s pomoshju poliethylenglykolja 6000.Interesujushaja Vas «meloch» budet v supernatante plavat.Vy ego prosto skoncentrirujte potom v slide-A-lysere polojiv etu kameru s rastvorom na Sephadex ili PEG Зависимость о размера есть, но не прямая. Лучше высаливаются кислые белки. Желательно работать при высокой концентрации белков. При низкой образование осадка идёт медленнее. По этой причине обычно рекомендуется использовать высаливание на самой первой стадии — для грубых экстрактов, содержащих большое количество примесей. При этом идёт сильное соосаждение, т.е. целевой белок захватывается осадком даже помимо своего «желания». Оптимальный вариант — это экстракционное высаливание, т.е. сначала осаждаете белок со всеми примесями, а потом растворяете осадок в дистиллированной воде и добавляете насыщенный раствор сульфата аммония в требуемой пропорции. Осадок растворяете и высаливаете повторно, но соотношение воды и соли понижаете, и т.д. Ко всем полученным супернатантам добавляете насыщенный раствор соли, центрифугируете и получаете серию осадков, в которых ищете свой белок. Если точка высаливания известна, то сразу ориентируетесь на требуемое соотношение воды и насыщенного раствора соли. Ступенчатую экстракцию можно проводить повторно и с различными интервалами процента насыщения раствора соли. Для крупных белков можно добиться осаждения в интервале 1. 2% насыщения, причём без существенных потерь. Для мелких интервал требуется немного шире (3. 5%). Главное — дистиллированную воду брать только свежекипячёную. Иначе белки погибнут от «кессонной болезни». наверное, в общем и целом, маленькие белки будут высаливаться хуже. но и зависимость от других их свойств и от присутствия в растворе других белков тоже будет немалой. помимо вышеуказанных способов, эффективность высаливания можно повысить еще боюсь, с pH не шибко получится, потому что: с температурой согласен 1. рН можно довести после добавления СА 2 Maya: A vy sluchem ne FEN NGU zakanchivali? При осаждени белка персульфатом аммония насколько важно чтоб центрифугирование проводилось с охлаждением? и достаточно ли 10000 т.о. (на цф типа эппендорф) минут пяти? Вы слегка перепутали. Персульфат аммония — реактив, который используется обычно для инициации полимеризации акриламидного геля. Белки фракционируют сульфатом аммония. Для осаждения (переосаждения) белков сульфатом не обязательно охлаждать все в процессе ц/ф. Вполне можно обойтись настольной высокооборотной центрифугой (эппендорф очень даже подходит). Условия ц/ф (время и обороты) зависят от конечной концентрации сульфата аммония в растворе. спасибо! Кстати, иногда при высоких концентрациях сульфата белки не тонут, а всплывают. Табличка насыщения сульфата дана при 0С, при комнате растворимость сульфата выше и следовательно процент насыщения при той же концентрации ниже. Но все это фигня, потаму чта сульфат есть грубый реагент и никакие тонкости не повысят точность фракционирования. Кстати, иногда при высоких концентрациях сульфата белки не тонут, а всплывают. . все это фигня, потаму чта сульфат есть грубый реагент и никакие тонкости не повысят точность фракционирования. Белки могут всплывать как при высоких, так и при низких концентрациях сульфата аммония. При растворении соли выделяются микропузырьки воздуха, которые придают осадкам белка положительную плавучесть. Для борьбы с этим желательно: Сульфат — очень тонкий реагент, позволяющий фракционировать даже близкие по свойствам белки. Мне удавалось при помощи высаливания разделить фикоцианин и фикоэритрин синезелёной водоросли, отличающиеся только хромофорной группой. Высаливание при этом проводилось изменением насыщения соли на 0,1%. Есть множество тонкостей, позволяющих повысить точность фракционирования при высаливании белков. —Сульфат — очень тонкий реагент, позволяющий фракционировать даже близкие по свойствам белки. Мне удавалось при помощи высаливания разделить фикоцианин и фикоэритрин синезелёной водоросли, отличающиеся только хромофорной группой. Высаливание при этом проводилось изменением насыщения соли на 0,1%. НЕ ВЕрю. Особенно, если в смеси была хотябы еще парочка десятков других белков в значимой концентрации. Хотя с конкретно этими белками я не знаком возможно это и так, но это скорее исключение чем правило. Есть множество тонкостей, позволяющих повысить точность фракционирования при высаливании белков. А клоны антител не пробовали делить из поликлональных сывороток. Белки могут всплывать как при высоких, так и при низких концентрациях сульфата аммония. Ага! А плотность раствора соли тут ни при чем. —Сульфат — очень тонкий реагент, позволяющий фракционировать даже близкие по свойствам белки. Мне удавалось при помощи высаливания разделить фикоцианин и фикоэритрин синезелёной водоросли, отличающиеся только хромофорной группой. Высаливание при этом проводилось изменением насыщения соли на 0,1%. НЕ ВЕрю. Особенно, если в смеси была хотябы еще парочка десятков других белков в значимой концентрации. Хотя с конкретно этими белками я не знаком возможно это и так, но это скорее исключение чем правило. Высаливание проводилось из грубого лизата синезелёных водорослей, содержащего десятки основных и тысячи дополнительных белковых примесей. С тех пор я не верю учебникам, описывающим красивую теорию высаливания белков. Спустя пару десятков лет развлекался с выделением пероксидазы хрена. У неё точка высаливания где-то на 68 % насыщения. Точнее не определял, но основную часть примесей удавалось убрать высаливанием в интервале 5% насыщения. Вообще-то воможность проводить тонкое фрационирование белков, меняя концентрацию сульфата аммония на 0,1% вызывает ОЧЕНЬ большие сомнения. Сульфат-аммонийное фракционирование прекрасный метод, он особенно хорош для фракционирования лизатов-гомогенатов, сывороток и т.д., легко маштабируется, хорошо воспроизводится, но не надо делать из него какую-то «сверхметодику сверхочистки». Что касается флотации белка после высаливания, то «всплывание» белка определяется и концентрацией сульфата аммония и природой белка. —С тех пор я не верю учебникам, описывающим красивую теорию высаливания белков. По учебникам как раз получается, что возможно все. —Например, при фрационировании гомогената печени 0,7 насыщения сульфата, Та, язный пень, чем больше липидов связано с белками, тем легче оне взплывають, как на парашюте. Не сомневайтесь. Интервал 1. 2% вполне работоспособен. С интервалом 0,1% будут заморочки, но и это вполне реально. Нужно только использовать не повышение концентрации, а экстракционное высаливание с понижающейся концентрацией. Могу поделиться секретами и тонкостями этого метода, но боюсь, что это уже никому не нужно . Народ давно уверовал в гель-хроматографию, иоообменники, HPLC и прочие навороты. Бороться со сторонниками общепринятых подходов — занятие крайне неблагодарное . —С тех пор я не верю учебникам, описывающим красивую теорию высаливания белков. По учебникам как раз получается, что возможно все. Это был Витальич. Уважаемый genseg, не поделитесь ли секретами? Мне иногда приходится работать в «полевых условиях» при отсутствии прочих возможностей. Использую обычно высаливание сульфатом, процедура отработана уже. Но если есть тонкости процесса, буду очень благаодарна за помощь. Спасибо. Основные принципы довольно просты, но мне уже неоднократно доставалось от местных всезнаек. По этой причине лучше обсуждать вопросы высаливания в приватной переписке. Если интерес серьёзен, то жмите на рисунок письма над этим сообщением и пишите на E-mail. Уважаемый genseq. Экстракционное высаливание действительно очень хорошая модификация сульфат-аамонийного фракционирования. Не требует ни какого специального оборудования или реактивов, дает неплохой выигрыш в очистке при существенном снижении потерь целевого белка на соосаждении с другими. На мой взгляд, эти плюсы с лихвой компенсируют незначительное удлинение всей процедуры. Правда, этот вариант требует гораздо большей тщательности и аккуратности в работе — просто более высокой биохимической культуры. ++11 Огромное спасибо форме жизни. Постараюсь соответствовать заданному им уровню дискуссии и поделиться своим небольшим опытом в деле высаливания белков, тем более, что письма от NBSC я так и не получил . В стародавние времена довелось мне делать дипломную работу в Ин-те биологии внутренних вод и водоёмов. Тамошние биологи пожелали сделать «что-нибудь биохимическое» и для этой цели выписали студента-биохимика (т.е. меня). Единственным объектом, с которым можно было успеть сделать хоть что-нибудь путное, оказались синезелёные водоросли, а единственным удобоваримым прибором — спектрофотометр СФ-4. Поневоле пришлось заняться ярко окрашенными белками — билихромопротеидами. Центрифуги там тоже не было (не говоря уж об ионообменниках) и кроме высаливания, причём с фильтрованием осадков, воспользоваться было не чем. Кстати, фильтров тоже не было, поэтому использовалась обычная стекловата, которой набивались сделанные из пипеток колонки. Первые же эксперименты показали, что для отделения осадков наиболее критичным параметром является скорость фильтрования. Если она превышала 1. 1,5 мл/мин*см2, то ярко-синие осадки уходили в проскок. Но на малой скорости и при последовательном повышении концентраций окрашенные белки нарушали все известные теории — при достижении критической концентрации сульфата аммония растворимость ярко-синего фикоцианина падала до нуля, причём очень резко — при изменении насыщения раствора сульфатом аммония всего на 0,1-0,2%. Правда, испортить весь опыт могла даже небольшая вибрация рабочего стола. На синих белках это было очень хорошо заметно. Для подтверждения подобного «аномального» высаливания фикоцианина был поставлен незасимый эксперимент — растворы с разной концентрацией сульфата аммония были приготовлены прямо в кюветах спектрофотометра, и образование осадков оценивалось по снижению оптической плотности раствора. Графики высаливания и в этом случае оказались аномальными — растворимость падала практически отвесно, но осадки вблизи точки высаливания были чрезвычайно лабильными — переходили опять в раствор даже при незначительных вибрациях, связанных с перемещением кювет. Впоследствии такой характер высаливания был продемонстрирован и на гемоглобине крови. От экспериментов с кровью у меня до сих пор остался небольшой шрам на руке . Основной вывод таков: Ну а следствия этого вывода и способы использования данного феномена для тонкой очистки белков с помощью высаливания постараюсь описать завтра. Сейчас уже пора убегать . Форму Жизни я тоже благодарю Уважаю А Генсека стал еще больше уважать Прикрепить сию полезную тему к методическому разделу форума! Вот например сюда http://molbiol.ru/protocol/17_15.html ( http://molbiol.ru/protocol/17_15.html ) Похоже, пора от преамбулы переходить к амбуле — к хитростям, которые должен знать каждый начинающий высаливатель белков. 1. Кессонная болезнь, т.е. образование микропузырьков при растворении соли или при смешивании её насышенного раствора с водой. Это приводит к значительным потерям, поскольку осадки начинают всплывать, а часть белков в них необратимо денатурируется. При однократном высаливании этими потерями можно пренебречь, но при многократном высаливании теряется всё. Проблема решается использованием для растворения осадков перед повторным их осаждением свежекипячёной («обезгаженной») воды. 2. Соосаждение, т.е. захват осадками белков, которые при данной концентрации соли ещё вполне растворимы. Если высаливать белки повышением концентрации соли, то их соосаждение приводит к получению очень невнятных результатов. а вот если идти не снизу в верх, а сверху вниз, и проводить экстракционное высаливание, то с соосаждением можно бороться повторной экстракций. В общих чертах экстракционное высаливание выглядит следующим образом: При таком подходе можно повторять пункты в) и г) тем же соотношанием 5,5:4,5. При этом из осадка извлекаются белки, которые обязаны пребывать во фракции 45. 50%. Ко всем полученным супернатантам (по 10 мл) можно добавить по 1 мл насыщенного раствора соли, получить осадки и провести повторное экстракционное высаливание с интервалом 1. 2% насыщения. Потери, связанные с соосаждением белков, будут уже намного меньше. Кстати, чем чище препарат белка, тем меньше проявляются фокусы, связанные с соосаждением. Продолжу завтра . Класс! С нетерпением буду ждать продолжения Уважаемый genseq, извините за поздний ответ. Не всегда есть возможность воспользоваться интернетом. Все, что вы уже рассказали, безумно интересно! Сейчас постараюсь осознать собственные ошибки в работе и исправить положение. Если будет продолжение — всеми конечностями — за! Спасибо. Боюсь, что девушки ждут молока от старого козла. Ну-ну. . Впрочем, на кое-что я ещё способен . Как правило, при высаливании ориентируются на минимальную концентрацию сульфата аммония (процент насыщения), при которой требуемый белок выпадает в осадок. Более продвинутые специалисты предпочитают использовать интервал концентрации соли, который обычно составляет от 10 до 20% насыщения и очень редко — 5%. Метод считается очень грубым и используется на самой первой стадии, когда требуется избавиться от липидов, грубого дебриза, углеводов и низкомолекулярных примесей, способных загубить дорогостоящия колонки (см. форму жизни). При этом большие потери считаются нормой жизни. В действительности всё совсем не так, как на самом деле. Высаливание пригодно и для грубой очистки (причём без особых потерь), и для тонкого фракционирования. Для грубой очистки необходимо знать интервал насыщения, при котором белок выпадает в осадок (10. 20% насыщения). Основные потери связаны с соосаждением целевого белка, ну а способ борьбы с этим (повторное экстракционное высаливание) мы уже обсуждали. Впрочем, из каждого правила есть исключения — например, захват белка осадком может быть обусловлен и межмолекулярной сшивкой сульфгидрильных групп, но подобные фокусы и способы борьбы с ними нужно обсуждать отдельно. Итак, после экстракционного высаливания грубого лизата (центрифугированного гомогената) с интервалом насыщения 10. 20% обычно получается белковый осадок кремового цвета, содержащий основную часть целевого белка и пригодный, например, для гель-хроматографии. После этого можно переходить к высаливанию с интервалом 2. 5%. Только не нужно забывать о том, что для каждого белка характерен не интервал, а точка высаливания, значение которой отличается исключительной стабильностью. Многократные центрифугирования (или фильтрования) необходимы только для максимально точного определения этой точки. В дальнейшем головной боли от жужжания центрифуги будет намного меньше. Скорость формирования осадков при высаливании белков очень сильно зависит от их концентрации. Разведённые растворы ( /18.08.2007 08:10/ Кстати, о высаливании. Этот вопрос уже обсуждался на форуме: Вопрос был сформлирован следующим образом: Ну а мой ответ не слишком сильно отличался от всего вышесказанного: «Зависимость от размера есть, но не прямая. Лучше высаливаются кислые белки. Желательно работать при высокой концентрации белков. При низкой образование осадка идёт медленнее. По этой причине обычно рекомендуется использовать высаливание на самой первой стадии — для грубых экстрактов, содержащих большое количество примесей. При этом идёт сильное соосаждение, т.е. целевой белок захватывается осадком даже помимо своего «желания». Оптимальный вариант — это экстракционное высаливание, т.е. сначала осаждаете белок со всеми примесями, а потом растворяете осадок в дистиллированной воде и добавляете насыщенный раствор сульфата аммония в требуемой пропорции. Осадок растворяете и высаливаете повторно, но соотношение воды и соли понижаете, и т.д. Ко всем полученным супернатантам добавляете насыщенный раствор соли, центрифугируете и получаете серию осадков, в которых ищете свой белок. Если точка высаливания известна, то сразу ориентируетесь на требуемое соотношение воды и насыщенного раствора соли. Ступенчатую экстракцию можно проводить повторно и с различными интервалами процента насыщения раствора соли. Для крупных белков можно добиться осаждения в интервале 1. 2% насыщения, причём без существенных потерь. Для мелких интервал требуется немного шире (3. 5%). Боюсь, что девушки ждут молока от старого козла. Ну-ну. . Впрочем, на кое-что я ещё способен . Вот что меня безумно радует в мужчинах , так это их уникальное кокетство и способность напрашиваться на комплименты Вообще-то это была самокритика . Генсек, уже поздно — Яна уже втюрилась виртуально. Но вы же там соседи. Во-первых, прошу не путать Яру с Яной, с детства этого не терплю Уважаемый genseq. Завидую вашей удачливости. Вам удается растворять 1-2г белкового осадка в 5 мл воды (наверное, лучше все-таки буфера?). Увы, мне не везло с белками и растворы с концентрацией белко 100 мг/мл у меня не получаются. Наверное, мы недопонимаем друг друга. Я говорю о суммарном белке, концентрация которого измеряна (в соответствующем разведении, конечно) по Бредфорду или по Лоури. А вы о каком белке? не думаю, что «уже поздно», но мне нравится ход твоих мыслей . Спасибо форме жизни. Он совершенно прав, но я постараюсь быть ещё правее. 1. Белки, как правило, растворяют в буфере, предназначенном для поддержания заданного pH. Сульфат аммония — соль кислая. Её растворы имеют pH 5,0, а попытки защелочить их до привычного всем нейтрального или слабощелочного значения приводят к появлению аммиачной вони. Лучше просто не бояться кислых значений pH. Их денатурирующее воздействие на белки при высаливании, как правило, компенсируется повышением стабильности белков в концентрированных солевых растворах. Кстати, некоторые ферменты, плохо переносящие лиофилизацию (бета-галактозидаза и т.п.) хранятся и поставляются в виде суспензии в растворе сульфата аммония. Скорее всего, из этого правила есть исключения. Тогда лучше использовать для высаливания забуференные растворы сульфата натрия или насыщенные растворы двузамещённого фосфата натрия (pH 2. Растворимость белков очень сильно зависит от ионной силы растворов. При низкой ионной силе растворимость многих белков незначительна, а если ещё и pH соответствует изоэлектрической точке белка, то он может вывалиться в осадок полностью. На этом основан метод изоэлектрического осаждения, активно использовавшийся на заре энзимологии. При повышении ионной силы растворимость быстро увеличивается и может достигать запредельных значений. Наконец, при приближении концентрации соли к точке высаливания растворимость снижается. Если белок очищенный, то она падает практически отвесно. Если очень «грязный», то график имеет куполообразных характер, сглаженный эфектами соосаждения. Форма жизни совершенно прав. В буферном растворе многие белки растворяются весьма посредственно. Но вот сульфат-аммонийные осадки в небольшом объёме воды растворяются необычайно хорошо. Можно, конечно, растворять их и в небольшом объёме буфера, но это приведёт к непредсказуемости pH, так что лучше использовать именно воду. Будет, конечо, кисловато, но лучше так, чем иметь головную боль от непредсказуемой pH или от постоянного запаха аммиака . В целом горячо одобряю, а вот в частности Вы описали несколько ухудшенную модификацию экстракционного высаливания. Ухудшение заключается в том, что при растворении осадка (фракции 80% насыщения) в растворе сульфата аммония (60% насыщения) потери целевого белка будут выше, чем при полном растворении осадка. Слишком много его останется в соосаждённом виде с белками фракции 0. 60%. Ну а как этого избежать мы уже рассматривали . Ну ни тема, а учебник по высаливанию! Среди нас только одна девушка — это Яра! Признаю. что Ярослава могла вдохновить мужчин на подвиги, а Генсека точно . На форуме было по крайней мере три темы о высаливании. Сейчас они объединены в одну и эта тема прикреплена к методике высаливания в «Методах» (смотри первое сообщение в теме). Прошу прощения, но мне бы хотелось сказать «несколько тёплых слов» Ирине, участвующей здесь под ником NBSC. У неё очень непростая задачка — выделение в полевых условиях физиологически активного высоколабильного белка из гемолимфы, причём осаждается он при 70. 75% насыщения сульфата аммония. Основная задача — уменьшить потери, связанные как с высаливанием, так и с инактивацией. Все белки сыворотки крови (и не только) на заре их препаративной химии были разделены на глобулины, осаждающиеся при 50% насыщения сульфата аммония, и альбумины, не выпадающие при этой концентрации соли в осадок. В соответствии с этой классификацией белок Ирины относится к альбуминам и является далеко не самым лучшим объектом для высаливания. Кроме того, известна только ориентировочная концентрация, при которой он выпадает в осадок (70. 75% насыщения). Попытаюсь дать несколько самых общих советов, в правильности которых не слишком уверен. Дело в том, что при высаливании подобных белков исключений может быть не меньше, чем правил. 1. Определите концентрацию соли (нижнюю границу), при которой белок ещё не выпадает в осадок, или частично выпадает, но может быть экстрагирован (см. выше разглагольствования о соосаждении). Если это 60% насыщения, то удастся избавиться от всех глобулинов и даже от значительной части альбуминов. Хорошо бы высолить основной альбумин вашей гемолимфы. При этом и потери могут быть незначительными (стабилизирующее влияние высоких концентраций соли), и очистка весьма ощутимой. Похоже, Ваша проблема ещё и в том, что даже при 75% насыщения есть подозрения, что значительная часть белка остаётся в супернатанте. С более высокими концентрациями соли работать уже слишком проблематично. В таком случае лучше перейти с высаливания на другие способы концентрирования (ультрафильтрация, обратный осмос и т.п.). Кроме того, требуемой физиологической активностью могут обладать несколько белков. В этом случае получить достаточно внятные результаты при солевом фракционировании будет невозможно. Существуют и индивидуальные особенности белков, мешающие их очистке при помощи высаливания. В общем, возможны проблемы , но из-за их непредсказуемости лучше сейчас не заморачивать Вам голову. Начните с поиска точного интервала высаливания, а там будет видно. Добрый день! Уважаемые коллеги! Вообще-то, заниматься сульфат-аммонийным фракционированием белков в полевых условиях дело очень сложное. Правда, понятие «полевые условия» довольно растяжимое и зависит от конкретного «поля». Выделение из гемолимфы — значит объект беспозвоночные, скорее всего моллюски, и следовательно, объем исходного материала весьма ограничен. Лучше всего «засолить» белок сульфатом, собрать осадок (можно фильтрацией), довести до лаборатории и там с ним работать. Наличие мочевины в лизирующем буфере никак не мешает высаливанию белков. Только два замечания: 1) если концентрация мочевины в лизирующем буфере высокая, то уже свыше 0,5 насыщения сульфата белок будет флотировать. Это не страшно, но создает некоторые неудобства — надо ц\ф при более высоких оборотах чем обычно; 2) ваш белок из сульфат-аммонийного осадка скорее всего не будет растворяться в воде (буфере), если не добавить мочевины. Форма жизни, спасибо! Форма жизни и genseq, спасибо! Ваша информация для меня очень важна. Извините за глупый вопрос: а почему Нуклеиновые кислоты сульфатом не высаживатся? Почему сульфат от них с таким же успехом воду не отнимает? Нуклеиновые кислоты сильно гидрофильнее белка. Чтобы они выпали сами собой нужно либо добавить спирт. Либо создать специальные условия,например сильноразвитую поверхность, типа селикагеля, он же гласмилк. Я так понимаю, что уже поздно что либо писать, но я Яна и реально существую на сайте уже давно, поэтому папрашу осторожнее с никами только на сайт захожу очень редко поэтому только сейчас прочитала про «инсинуации» в мой адрес. А за тему спасибо, несколько полезных идей для себя подчерпнула. Высаливание биополимеров ингода преподносит удивительные сюрпризы. Лет 20 назад был опубликован и запатентован весьма оригинальный способ выделения ДНК из молок лососевых раб с помощью высаливания. Суть очень проста. Гомогенат молок обрабатывается сульфатом аммония до 0,9 насыщения по сульфату и полученный весьма мутный раствор разбавляется водой в 10 раз. Выпадает в осадок (точнее всплывает) ДНП — комплекс ДНК-протамин, который легко отделяется от всего остального фильтрованием или центрифугированием. Затем ДНП растворяют в 2 М NaCl и теперь уже чистую ДНК отфильтровывают от денатурированного белка и высаживают спиртом. Фактически идет «игра» на разной растворимости ДНК, белков и комплекса ДНК-протамин (ДНП) в растворах солей разной концентрации. На Хабаровском химфармзаводе даже было изготовлено несколько партий ДНК по этой технологии. . либо цетавлон. А вот как выяснилось да же без добавления спирта или участия сильноразвитой поверхности в осадок попадает низкомолекулярные НК уже при 70% от точки насыщения. Выпадают они сами по себе или по той причине что сами связыны с выпадающими белками-не проверялось, но теоритически в такой высокой ионной силе ионные взаимодействия неосуществимы, и если это действительно падение НК из-за связи с белком, то эти НК связаны с белками водородными связями. Короче так или иначе-падают НК при добавлении сульфата. Что-то вас занесло. Возьмите любую ДНК, которую вам не жалко и попытайтесь ее высолить любой концентрацией сульфата. Увы, осадок не образуется. Поэтому ваше «выяснилось» это просто некорректно поставленный эксперимент. =) Уважаемый критик, прочтите внимательно предпоследний пост:»в осадок попадает низкомолекулярные НК . Выпадают они сами по себе или по той причине что сами связыны с выпадающими белками-не проверялось». *поправочка: «то что не будет 100% очистки от них(НК) ПРИ ОСАЖДЕНИИ БЕЛКОВ КЛЕТОЧНОГО ЛИЗАТА — показано» Здравствуйте! —не осаждаются ли они —не изменяют ли своих свойств? Строго говоря они их изменяют уже тогда, когда вы извлекли их из кровотока. источники: http://www.belok-s.narod.ru/pr_4.htm http://molbiol.ru/protocol/17_15.html |